Souprava Cell Direct RT qPCR—SYBR GREEN I Direct Cell Lysis Cell Ready Soupravy qRT-PCR v jednom kroku
Popisy
Tato souprava využívá unikátní systém lyzačního pufru, který dokáže rychle uvolnit RNA ze vzorků kultivovaných buněk pro reakce RT-qPCR, čímž eliminuje časově náročný a pracný proces purifikace RNA.Templát RNA lze získat za pouhých 7 minut.5×Direct RT Mix a 2×Reagencie Direct qPCR Mix-SYBR dodávané v sadě mohou rychle a efektivně získat kvantitativní výsledky PCR v reálném čase.
5×Direct RT Mix a 2×Direct qPCR Mix-SYBR mají silnou toleranci inhibitorů a lyzát vzorků lze použít přímo jako templát pro RT-qPCR.Tato sada obsahuje unikátní RNA vysoce afinitní reverzní transkriptázu Foregene a Hot D-Taq DNA polymerázu, dNTPs, MgCl2, reakční pufr, PCR optimalizátor a stabilizátor.
Specifikace
200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns
Součásti stavebnice
| Část I | Buffer CL |
| Foregene Protease Plus II | |
| Buffer ST | |
| Část II | DNA Eraser |
| 5× Direct RT Mix | |
| 2× Direct qPCR Mix-SYBR | |
| 50× referenční barvivo ROX | |
| DdH2O bez RNázy | |
| Instrukce | |
Vlastnosti a výhody
■Jednoduché a efektivní: s technologií Cell Direct RT lze vzorky RNA získat za pouhých 7 minut.
■ Potřeba vzorku je malá, lze testovat pouze 10 buněk.
■ Vysoká propustnost: dokáže rychle detekovat RNA v buňkách kultivovaných na 384, 96, 24, 12, 6-jamkových destičkách.
■ DNA Eraser může rychle odstranit uvolněné genomy a výrazně snížit dopad na následné výsledky experimentů.
■ Optimalizovaný systém RT a qPCR činí dvoukrokovou reverzní transkripci RT-PCR účinnější a PCR specifičtější a odolnější vůči inhibitorům reakce RT-qPCR.
Aplikace sady
Oblast použití: kultivované buňky.
- RNA uvolněná lýzou vzorku: použitelná pouze pro RT-qPCR templát této soupravy.
- Soupravu lze použít pro následující účely: analýza genové exprese, ověření účinku umlčování genů zprostředkovaného siRNA, screening léků atd.
Diagram
Skladování a trvanlivost
Část I této sady by měla být skladována při 4 °C;Část II by měla být skladována při -20 °C.
Foregene Protease Plus II by měl být skladován při 4℃, nezmrazujte při -20 ℃.
Činidlo 2×Direct qPCR Mix-SYBR by měl být uložen při -20℃ve tmě;při častém používání může být také uložen na 4℃ pro krátkodobé skladování (spotřebujte do 10 dnů).
Principy návrhu primerů PCR v reálném čase
Forward Primer a Reverse Primer
Pro Real Time PCR je velmi důležitý návrh primeru.Primery souvisejí se specificitou a účinností PCR amplifikace a mohou být navrženy s ohledem na následující principy:
Délka primeru: 18-30 bp.
Obsah GC: 40-60 %.
Hodnota Tm: Software pro návrh primeru, jako je Primer 5, může poskytnout hodnotu Tm primeru.Hodnoty Tm upstream a downstream primerů by měly být co nejblíže.Lze také použít vzorec pro výpočet Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Při provádění PCR se jako teplota nasedání obecně volí teplota pod hodnotou Tm primeru 5 °C (odpovídající zvýšení teploty nasedání může zvýšit specifitu PCR reakce).
Primery a produkty PCR:
Délka amplifikačního produktu PCR návrhu primeru je výhodně 100-150 bp.
Navrhované primery v sekundární strukturální oblasti templátu by se měly co nejvíce vyhnout.
Vyhněte se tvorbě 2 nebo více komplementárních bází mezi 3' konci upstream a downstream primerů.
Základní 3′ terminálová základna nemůže být přítomna se 3 dalšími po sobě jdoucími G nebo C.
Primery samotné nemohou mít komplementární struktury, jinak se vytvoří vlásenková struktura ovlivňující PCR amplifikaci.
ATCG by mělo být distribuováno co nejrovnoměrněji v sekvenci primeru a 3' terminální báze by měla být vyloučena jako T.
Dodatek 1：Doplňkový balíček součástí sady Cell Direct RT-qPCR
1.Roztok pro buněčnou lýzu
|
| |||
| Součásti stavebnice (24-jamkový lyzační systém / jamka) | DRT-01011-A1 | DRT-01011-A2 | |
| 100 T | 500 T | ||
| Částjá | Buffer CL | 20 ml | 100 ml |
| Foregene Protease Plus II | 400 μl | 1 ml × 2 | |
| Buffer ST | 1 ml × 2 | 10 ml | |
| ČástII | DNA Eraser | 400 μl | 1 ml × 2 |
2.RT Mix
|
| |
| Součásti stavebnice (20 μl reakčního systému) | DRT-01011-B1 |
| 200 T | |
| 5× Direct RT Mix | 800 μl |
| ddH bez RNázy2O | 1,7 ml × 2 |
|
| ||
| Součásti stavebnice (20 μl reakčního systému) | DRT-01011-C1 | DRT-01011-C2 |
| 200 T | 1000 T | |
| 2× Direct qPCR Mix-SYBR | 1 ml × 2 | 1,7 ml × 6 |
| 50× referenční barvivo ROX | 40 μl | 200 μl |
| ddH bez RNázy2O | 1,7 ml | 10 ml |
Návody k použití:
