Průvodce analýzou problémů

Následující analýza problémů, se kterými se můžete setkatCelkem rostlinRNA extraction will help you with your experiments. In addition, for other experimental or technical problems in addition to operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. If you have any needs, please contact us at: 028-83360257 or E-mali : Tech@foregene.com.

Otočný sloupek je ucpaný

Zablokování spinové kolony způsobí, že výtěžek RNA bude snížen nebo dokonce nebude možné jej purifikovat za účelem získání RNA a kvalita získané RNA bude nízká.

Analýza běžných příčin:

1. Vzorek není úplně rozbitý.

Neúplná fragmentace vzorku může zablokovat kolonu pro čištění DNA, což může také ovlivnit výtěžek a kvalitu RNA.Při provádění fragmentace vzorku doporučujeme rychle rozemlít v dostatečném množství kapalného dusíku, aby se tkáně, jako jsou buněčné stěny a buněčné membrány, co nejvíce rozbily.Pro rostlinné vzorky polyfenolových polysacharidů doporučujeme použít Plant Total RNA Isolation Kit Plus.

2. Aspirujte izolovaný supernatant DNA-Cleaning Column, aspirujte možnou peletu buněčné drti.

Nasátá peleta z úlomků buněk může ucpat kolonu obsahující pouze RNA během adsorpčních postupů RNA (viz krok 5 postupu, krok 6 postupu polysacharidového polyfenolu).Doporučujeme, abyste při odsávání tohoto supernatantu byli opatrní, aby nedošlo k nasátí buněčných zbytků.

3. Počáteční množství vzorku je příliš velké.

Nadměrné použití vzorku bude mít za následek neúplnou fragmentaci vzorku nebo neúplnou lýzu buněk pufrem PRL1 nebo pufrem PSL1, což povede k ucpání purifikační kolony pro operace čištění.Plant Total RNA Isolation Kit má počáteční maximum 50 mg na jedno čištění operovaného vzorku.Pro rostlinné vzorky polyfenolových polysacharidů doporučujeme vyzkoušet Plant Total RNA Isolation Kit Plus.

4. Teplota odstředivky je příliš nízká.

Izolace a purifikace celé RNA kromě narušení tkáně vzorku kapalným dusíkem, všechny kroky se provádějí při pokojové teplotě (20-25 °C).Některé nízkoteplotní centrifugy mají teploty pod 20 °C, což může způsobit zablokování kolony pro čištění DNA a/nebo kolony pouze pro RNA.Pokud k tomu dojde, nastavte teplotu odstředivky na 20-25 °C a předehřejte lyzační směs a/nebo přidání ethanolového separačního supernatantu na 37 °C.

Žádná RNA extrahována nebo výtěžek RNA je nízký

Obvykle existuje mnoho faktorů, které ovlivňují účinnost regenerace, jako je: obsah RNA ve vzorku, operační metoda, eluční objem atd.

Analýza běžných příčin, jak je uvedeno níže:

1.Během operace byla provedena ledová lázeň nebo nízkoteplotní (4°C) centrifugace.

Doporučení: Celý proces provozujte při pokojové teplotě (15-25°C), neprovádějte ledovou lázeň a nízkoteplotní centrifugaci.

       2.RNA byla degradována v důsledku nesprávné konzervace vzorku nebo dlouhodobé konzervace vzorku.

Doporučení: Čerstvě odebrané vzorky by měly být rychle zmraženy v kapalném dusíku a poté skladovány při -80°C po dlouhou dobu, vyhněte se opakovanému zmrazování a rozmrazování vzorků;nebo vzorky ihned namočte do roztoku stabilizátoru RNA RNAlater (vzorky zvířat).

       3.Nedostatečná fragmentace vzorku a lýza vedou k zablokování purifikační kolony.

Návrh: Při mletí tkáně se prosím ujistěte, že je tkáň dostatečně rozemletá, a rychle ji přeneste do předem připraveného pufru PSL1 (ujistěte se, že byl přidán správný poměr β-ME, viz krok 1 postupu).

4. Eluent byl přidán nesprávně.

Návrh: Ujistěte se, že RNase-Free ddH₂O se nakape do středu membrány čistící kolony.

5. Do pufru PSL2 nebo pufru PRW2 nebyl přidán správný objem absolutního etanolu.

Doporučení: Postupujte podle pokynů, přidejte správný objem absolutního etanolu do pufru PSL2 a pufru PRW2 a před použitím soupravy dobře promíchejte.

6. Množství vzorku tkáně je nevhodné.

Doporučení: Použijte 50 mg tkáně na 500 μl pufru PSL1.Použití příliš velkého množství tkáně sníží množství extrahované RNA a sníží se také čistota výsledné RNA.Důrazně doporučujeme, aby počáteční dávka vzorku nepřesáhla 50 mg na operaci extrakce RNA.

7. Nevhodný eluční objem nebo neúplná eluce.

Návrh: Objem eluentu v purifikační koloně je 50-200 μl;pokud není eluční efekt uspokojivý, doporučuje se prodloužit dobu při pokojové teplotě po přidání předehřátého ddH bez RNázy₂O, například 5-10 min.

8. Čistící kolona obsahuje ethanolový zbytek po promytí pufrem PRW2.

   Návrh: Pokud je prázdná zkumavka centrifugována po dobu 1 minuty a po promytí v pufru PRW2 stále zbývá ethanol, můžete prodloužit dobu centrifugace prázdné zkumavky na 2 minuty nebo umístit purifikační kolonu při pokojové teplotě na 5 minut, abyste zcela odstranili zbytkový etanol.

9.Sada byla nesprávně použita.

   Návrh: U rostlinných vzorků polyfenolických polysacharidů nemusí být použití běžných souprav, jako je Plant Total RNA Isolation Kit, schopno získat ideální vzorky RNA.Doporučujeme vám použít Plant Total RNA IsolationKit Plus, který je speciálně navržen pro vzorky rostlin s polyfenolickými polysacharidy.Sada speciálně vyvinutá pro extrakci RNA z polyfenolových a polysacharidových rostlinných vzorků.

Hodnota OD260/OD280 je nízká

Eluce RNA s ddH₂O a použité pro odečty spektrofotometrem mají za následek nízké hodnoty OD260/OD280.Doporučujeme použít 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 (spíše než ddH bez RNázy₂O k eluci RNA), abyste získali relativně správné hodnoty OD260/OD280, viz „Testy koncentrace a purifikace RNA“ na straně 19.

Purifikovaná RNA je degradována

Kvalita purifikované RNA souvisí s faktory, jako je uchování vzorku, kontaminace RNázou a manipulace.

Analýza běžných příčin:

1.Vzorky tkání nebyly po odběru včas skladovány.

    Doporučení: Pokud vzorky tkáně po odběru nepoužijete včas, uložte je prosím ihned do tekutého dusíku při nízké teplotě nebo je po rychlém zmrazení v tekutém dusíku přeneste do -80°C k dlouhodobému skladování, případně vzorky ihned ponořte do roztoku stabilizátoru RNA RNAlater (vzorky zvířat ).Pro extrakci RNA zkuste použít čerstvě odebrané vzorky tkáně.

2.Opakované zmrazování a rozmrazování vzorků tkání.

   Návrh: Při skladování vzorků tkáně je nejlepší je nařezat na malé kousky pro konzervaci a část z nich vyjmout při použití, aby nedošlo k degradaci RNA způsobené opakovaným zmrazováním a rozmrazováním vzorků.

3.Na operačním sále je zavedena RNáza nebo nenošené jednorázové rukavice, masky atd.

   Návrh: Experimenty s extrakcí RNA se nejlépe provádějí v samostatných operacích s RNA a laboratorní stůl by měl být před experimentem vyčištěn a během experimentu by měly být používány jednorázové rukavice a masky, aby se v co největší míře zabránilo degradaci RNA způsobené zavedením RNázy.

4. Činidlo je během použití kontaminováno RNázou.

   Návrh: Nahraďte novou sérií souprav pro extrakci celkové rostlinné RNA pro související experimenty.

5. Centrifugační zkumavky a špičky pipet používané pro manipulaci s RNA jsou kontaminovány RNázou.

Doporučení: Ujistěte se, že centrifugační zkumavky, špičky pipet, pipety atd. používané při extrakci RNA jsou bez RNázy.

Návody k použití:

Návod k použití sady Plant Total RNA Isolation Kit