Vysvětlení základních pojmů molekulární biologie
1. cDNA a cccDNA: cDNA je dvouvláknová DNA syntetizovaná reverzní transkriptázou z mRNA;cccDNA je plazmidová dvouvláknová uzavřená kruhová DNA bez chromozomu.
2. Standardní skládací jednotka: jednotka sekundární struktury proteinu α-helix a β-list může tvořit strukturální bloky se speciálním geometrickým uspořádáním prostřednictvím různých spojovacích polypeptidů.Tento typ determinovaného skládání se obvykle nazývá supersekundární struktura.Těmito skládacími typy lze popsat téměř všechny terciární struktury a dokonce i jejich kombinované typy, proto se jim také říká standardní skládací jednotky.
3. CAP: cyklický adenosinmonofosfát (cAMP) receptorový protein CRP (cAMP receptorový protein), komplex vzniklý kombinací cAMP a CRP se nazývá aktivační protein CAP (cAMP aktivovaný protein)
4. Palindromická sekvence: Reverzní komplementární sekvence segmentu fragmentu DNA, často místa restrikčního enzymu.
5. micRNA: Komplementární interferující RNA nebo antisense RNA, která je komplementární k sekvenci mRNA a může inhibovat translaci mRNA.
6. Ribozym: RNA s katalytickou aktivitou, která hraje autokatalytickou roli v procesu sestřihu RNA.
7. Motiv: V prostorové struktuře proteinových molekul existují některé lokální oblasti s podobným trojrozměrným tvarem a topologií
8. Signální peptid: peptid s 15-36 aminokyselinovými zbytky na N-konci během syntézy proteinu, který řídí transmembránu proteinu.
9. Atenuátor: Nukleotidová sekvence mezi oblastí operátora a strukturním genem, která ukončuje transkripci.
10. Magic Spot: Když bakterie rostou a setkají se s úplným nedostatkem aminokyselin, bakterie vyvolají nouzovou reakci, aby zastavily expresi všech genů.Signály, které generují tuto nouzovou reakci, jsou guanosintetrafosfát (ppGpp) a guanosinpentafosfát (pppGpp).Role PpGpp a pppGpp není jen jeden nebo několik operonů, ale ovlivňuje jich velké množství, proto se jim říká superregulátory nebo magické skvrny.
11. Upstream promotorový element: odkazuje na sekvenci DNA, která hraje regulační roli v aktivitě promotoru, jako je TATA v oblasti -10, TGACA v oblasti -35, zesilovače a atenuátory.
12. DNA sonda: značený segment DNA se známou sekvencí, který se široce používá k detekci neznámých sekvencí a screeningu cílových genů.
13. SD sekvence: Je to vazebná sekvence ribozomu a mRNA, která reguluje translaci.
14. Monoklonální protilátka: Protilátka, která působí pouze proti jedné antigenní determinantě.
15. Kosmid: Je to uměle zkonstruovaný vektor exogenní DNA, který si zachovává oblasti COS na obou koncích fága a je spojen s plazmidem.
16. Skríning modro-bílých skvrn: Gen LacZ (kódující β-galaktosidázu), enzym může rozkládat chromogenní substrát X-gal (5-brom-4-chlor-3-indol-β-D-galaktosid) za vzniku modré, čímž se kmen změní na modrý.Když je vložena exogenní DNA, gen LacZ nemůže být exprimován a kmen je bílý, aby bylo možné testovat rekombinantní bakterie.Toto se nazývá modro-bílé stínění.
17. Cis-působící element: Specifická sekvence bází v DNA, která reguluje genovou expresi.
18. Klenowův enzym: Velký fragment DNA polymerázy I, kromě toho, že aktivita 5' 3' exonukleázy je odstraněna z holoenzymu DNA polymerázy I
19. Ukotvená PCR: používá se k amplifikaci požadované DNA se známou sekvencí na jednom konci.Na jeden konec neznámé sekvence byl přidán poly-dG konec a poté byly poly-dC a známá sekvence použity jako primery pro PCR amplifikaci.
20. Fúzní protein: Gen eukaryotického proteinu je spojen s exogenním genem a současně je exprimován protein složený z translace původního genového proteinu a exogenního proteinu.
Další termíny molekulární biologie
1. Fyzikální mapa DNA je pořadí, ve kterém jsou uspořádány (štěpené restrikční endonukleázou) fragmenty molekuly DNA.
2. Štěpení RNázy se dělí na dva typy (autokatalýza) a (heterokatalýza).
3. U prokaryot jsou tři iniciační faktory (IF-1), (IF-2) a (IF-3).
4. Transmembránové proteiny vyžadují vedení (signální peptidy) a role proteinových chaperonů je (pomáhá skládat peptidový řetězec do přirozené konformace proteinu).
5. Prvky v promotorech lze obecně rozdělit na dva typy: (prvky jádrového promotoru) a (prvky promotoru upstream).
6. Obsah výzkumu molekulární biologie zahrnuje především tři části: (strukturní molekulární biologie), (genová exprese a regulace) a (technologie rekombinace DNA).
7. Dva klíčové experimenty prokazující, že DNA je genetickým materiálem, jsou (pneumokoková infekce myší) a (T2 fágová infekce Escherichia coli).potenciál).
8. Mezi hnRNA a mRNA jsou dva hlavní rozdíly: (hnRNA je spojena v procesu přeměny na mRNA), (5' konec mRNA je přidán s m7pGppp čepičkou a na 3' konci mRNA kyselého (polyA) ocasu je navíc polyadenylace).
9. Výhody vícepodjednotkové formy proteinu jsou (podjednotka je ekonomická metoda využití DNA), (může snížit dopad náhodných chyb v syntéze proteinů na aktivitu proteinu), (aktivita může být velmi efektivně a rychle otevřena a uzavřena).
10. Hlavní obsah mechanismu skládání proteinů první nukleační teorie zahrnuje (nukleaci), (strukturální obohacení), (konečné přeskupení).
11. Galaktóza má dvojí účinek na bakterie;na jedné straně (může být použit jako zdroj uhlíku pro růst buněk);na druhé straně (je také součástí buněčné stěny).Proto je pro trvalou syntézu na úrovni pozadí zapotřebí cAMP-CRP-nezávislý promotor S2;současně je zapotřebí cAMP-CRP-dependentní promotor S1 k regulaci syntézy na vysoké úrovni.Transkripce začíná od (S2) s G a od (S1) bez G.
12. Technologie rekombinantní DNA je také známá jako (genové klonování) nebo (molekulární klonování).Konečným cílem je (přenést genetickou informaci DNA z jednoho organismu do jiného organismu).Typický experiment s rekombinací DNA obvykle zahrnuje následující kroky: (1) Extrahujte cílový gen (nebo exogenní gen) organismu dárce a enzymaticky jej spojte s jinou molekulou DNA (klonovacím vektorem) za vzniku nové rekombinantní molekuly DNA.② Molekula rekombinantní DNA je přenesena do buňky příjemce a replikována v buňce příjemce.Tento proces se nazývá transformace.③ Vyhledejte a identifikujte ty buňky příjemce, které absorbovaly rekombinantní DNA.④ Kultivujte buňky obsahující rekombinantní DNA ve velkém množství, abyste zjistili, zda je exprimován cizí podpůrný gen.
13. Existují dva typy replikace plazmidů: ty, které jsou přísně kontrolovány proteinovou syntézou hostitelské buňky, se nazývají (těsné plazmidy) a ty, které nejsou přísně kontrolovány proteinovou syntézou hostitelské buňky, se nazývají (relaxované plazmidy).
14. Reakční systém PCR by měl splňovat následující podmínky: a.DNA primery (asi 20 bází) s komplementárními sekvencemi na každém konci dvou řetězců cílového genu, který má být separován.b.Enzymy s tepelnou stabilitou, jako jsou: TagDNA polymeráza.c, dNTPd, požadovaná sekvence DNA jako templát
15. Základní reakční proces PCR zahrnuje tři stupně: (denaturace), (žíhání) a (extenze).
16. Základní proces transgenních zvířat obvykle zahrnuje: ①Zavedení klonovaného cizího genu do jádra oplodněného vajíčka nebo embryonální kmenové buňky;②Transplantace naočkovaného oplodněného vajíčka nebo embryonální kmenové buňky do ženské dělohy;③Úplný embryonální vývoj a růst Pro potomky s cizími geny;④ Použijte tato zvířata, která mohou produkovat cizorodé proteiny, jako chovný materiál pro chov nových homozygotních linií.
17. Hybridomové buněčné linie jsou generovány hybridizací (slezinných B) buněk s (myelomovými) buňkami, a protože (buňky sleziny) mohou využívat hypoxantin a (kostní buňky) zajišťují funkce buněčného dělení, mohou být pěstovány v HAT médiu.růst.
18. S prohlubujícím se výzkumem se nazývá první generace protilátek (polyklonální protilátky), druhá generace (monoklonální protilátky) a třetí generace (protilátky genetického inženýrství).
19. V současnosti je genetické inženýrství hmyzích virů zaměřeno především na bakulovirus, který se projevuje vnesením (exogenního toxinového genu);(geny, které narušují normální životní cyklus hmyzu);(modifikace virových genů).
20. Trans-působící proteinové faktory odpovídající společným prvkům TATA, GC a CAAT v promotoru savčí RNA polymerázy II jsou (TFIID), (SP-1) a (CTF/NF1).
dvacet jedna.Základními transkripčními faktory RNA polymerázy Ⅱ jsou TFⅡ-A, TFⅡ-B, TFII-D, TFⅡ-E a jejich vazebná sekvence je: (D, A, B, E).V čem je funkce TFII-D (vazba na TATA box).
dvacet dva.Většina transkripčních faktorů, které se vážou na DNA, funguje ve formě dimerů.Funkční domény transkripčních faktorů, které se vážou na DNA, jsou běžně následující (helix-turn-helix), (motiv zinkového prstu), (bazický-leucin) motiv zipu).
dvacet tři.Existují tři typy režimů štěpení restrikční endonukleázou: (řez na 5' straně osy symetrie pro vytvoření 5' lepivých konců), (řez na 3' straně osy symetrie pro vytvoření 3' lepivých konců (řez na ose symetrie pro vytvoření plochých segmentů)).
dvacet čtyři.Plazmidová DNA má tři různé konfigurace: (SC konfigurace), (oc konfigurace), (L konfigurace).První v elektroforéze je (SC konfigurace).
25. Exogenní systémy genové exprese, zejména (Escherichia coli), (Kvasinky), (Hmyz) a (Tabulka savčích buněk).
26. Běžně používané metody pro transgenní zvířata jsou: (metoda retrovirové infekce), (metoda mikroinjekce DNA), (metoda embryonálních kmenových buněk).
Aplikace Molekulární biologie
1. Vyjmenuj funkce více než 5 RNA?
Přenos RNA tRNA Přenos aminokyseliny Ribozom RNA rRNA Ribozom tvoří messenger RNA mRNA Šablona pro syntézu proteinů Heterogenní jaderná RNA hnRNA Prekurzor zralé mRNA malá jaderná RNA snRNA Podílí se na sestřihu hnRNA Malá cytoplazmatická RNA scRNA/7SL-RNA protein Složky exprese plazmové retikulum a genová RNA rozpoznávání signálů plazmové RNA a syntetikum-RNA Ribozyme RNA Enzymaticky aktivní RNA
2. Jaký je hlavní rozdíl mezi prokaryotickými a eukaryotickými promotory?
Prokaryotický TTGACA --- TATAAT------ Místo iniciace-35 -10 Eukaryotický zesilovač---GC ---CAAT----TATAA-5mGpp- Místo iniciace-110 -70 -25
3. Jaké jsou hlavní aspekty umělé konstrukce přírodních plazmidů?
Přírodní plazmidy mají často defekty, takže nejsou vhodné pro použití jako nosiče pro genetické inženýrství a musí být modifikovány a konstruovány: a.Přidejte vhodné selekční markerové geny, jako jsou dva nebo více, které lze snadno použít pro selekci, obvykle antibiotické geny.b.Zvyšte nebo snižte vhodná místa štěpení enzymů pro usnadnění rekombinace.C.Zkraťte délku, odřízněte nepotřebné úlomky, zvyšte efektivitu importu a zvyšte nosnost.d.Změňte replikon z těsného na volný, z méně kopií na více kopií.E.Přidejte speciální genetické prvky podle speciálních požadavků genetického inženýrství
4. Uveďte příklad metody pro diferenciální screening tkáňově specifické cDNA?
Připraví se dvě buněčné populace, cílový gen je exprimován nebo vysoce exprimován v jedné z buněk a cílový gen není exprimován nebo exprimován málo v druhé buňce, a poté je cílový gen nalezen hybridizací a srovnáním.Například během výskytu a vývoje nádorů budou nádorové buňky prezentovat mRNA s různými úrovněmi exprese než normální buňky.Proto mohou být geny související s nádory skrínovány diferenciální hybridizací.Indukční metoda může být také použita pro screening genů, jejichž exprese je indukována.
5. Generování a screening hybridomových buněčných linií?
B lymfocyty sleziny + myelomové buňky, přidejte polyethylenglykol (PEG) k podpoře buněčné fúze a fúzní buňky B-myelomu sleziny pěstované v médiu HAT (obsahujícím hypoxantin, aminopterin, T) pokračují v expanzi výživy.Buněčná fúze obsahuje: fúzní buňky slezina-slezina: neschopné růstu, buňky sleziny nelze kultivovat in vitro.Fúzní buňky kost-kost: nemohou využívat hypoxanthin, ale mohou syntetizovat purin druhou cestou pomocí folát reduktázy.Aminopterin inhibuje folátreduktázu, a proto nemůže růst.Fúzní buňky kost-slezina: mohou růst v HAT, buňky sleziny mohou využívat hypoxantin a kostní buňky zajišťují funkci buněčného dělení.
6. Jaký je princip a způsob stanovení primární struktury DNA metodou dideoxy terminální terminace (Sangerova metoda)?
Princip spočívá v použití terminátoru nukleotidového řetězce – 2,,3,-dideoxynukleotidu k ukončení extenze DNA.Protože postrádá 3-OH potřebný pro tvorbu 3/5/fosfodiesterových vazeb, po začlenění do řetězce DNA nelze řetězec DNA dále prodlužovat.Podle principu párování bází, kdykoli DNA polymeráza potřebuje dNMP k účasti v normálně prodlouženém řetězci DNA, existují dvě možnosti, jedna je účastnit se ddNTP, což vede k ukončení prodloužení deoxynukleotidového řetězce;druhý je účastnit se dNTP, takže řetězec DNA se může stále prodlužovat, dokud není začleněn další ddNTP.Podle této metody lze získat skupinu fragmentů DNA různých délek končících na ddNTP.Metodou je rozdělení do čtyř skupin, respektive ddAMP, ddGMP, ddCMP a ddTMP.Po reakci může elektroforéza na polyakrylamidovém gelu číst sekvenci DNA podle plaveckých pásů.
7. Jaký je pozitivní regulační účinek aktivátorového proteinu (CAP) na transkripci?
Cyklický adenylátový (cAMP) receptorový protein CRP (cAMP receptorový protein), komplex tvořený kombinací cAMP a CRP se nazývá CAP (cAMP aktivovaný protein).Když se E. coli pěstuje v médiu bez glukózy, syntéza CAP se zvyšuje a CAP má funkci aktivace promotorů, jako je laktóza (Lac).Některé promotory závislé na CRP postrádají typický znak sekvence -35 oblasti (TTGACA), který mají běžné promotory.Proto je pro RNA polymerázu obtížné se na ni vázat.Přítomnost CAP (funkce): může významně zlepšit vazebnou konstantu enzymu a promotoru.Ukazuje především následující dva aspekty: ① CAP pomáhá molekule enzymu správně se orientovat změnou konformace promotoru a interakcí s enzymem tak, aby se spojila s oblastí -10 a hrála roli nahrazení funkce oblasti -35.②CAP může také inhibovat vazbu RNA polymerázy na jiná místa v DNA, čímž zvyšuje pravděpodobnost vazby na její specifický promotor.
8. Jaké kroky obvykle zahrnují typický experiment rekombinace DNA?
A.Extrahujte cílový gen (nebo exogenní gen) organismu dárce a enzymaticky jej spojte s jinou molekulou DNA (klonovacím vektorem) za vzniku nové rekombinantní molekuly DNA.b.Přeneste molekulu rekombinantní DNA do buňky příjemce a replikujte ji a uchujte ji v buňce příjemce.Tento proces se nazývá transformace.C.Vyhledejte a identifikujte ty recipientní buňky, které absorbovaly rekombinantní DNA.d.Hromadně kultivujte buňky obsahující rekombinantní DNA, abyste zjistili, zda je exprimován cizí podpůrný gen.
9. Konstrukce genové knihovny Jsou uvedeny tři metody screeningu rekombinantů a stručně popsán proces.
Screening antibiotické rezistence, inzerční inaktivace rezistence, screening modrobílých skvrn nebo PCR screening, diferenciální screening, DNA sonda Většina klonovacích vektorů nese geny antibiotické rezistence (anti-ampicilin, tetracyklin).Když je plazmid přenesen do Escherichia coli, bakterie získají rezistenci a ty bez přenosu nebudou mít rezistenci.Nedokáže však rozlišit, zda došlo k její reorganizaci či nikoli.Ve vektoru obsahujícím dva geny rezistence, pokud je cizí fragment DNA vložen do jednoho z genů a způsobí inaktivaci genu, lze ke screeningu pozitivních rekombinantů použít dvě kontroly destičky obsahující různá léčiva.Plazmid pUC například obsahuje gen LacZ (kódující β-galaktosidázu), který může rozkládat chromogenní substrát X-gal (5-brom-4-chlor-3-indol-β-D-galaktosid) za vzniku modré, čímž se kmen změní na modrou.Když je vložena cizí DNA, gen LacZ nemůže být exprimován a kmen je bílý, aby bylo možné provést screening rekombinantních bakterií.
10. Vysvětlete základní proces získávání transgenních zvířat prostřednictvím embryonálních kmenových buněk?
Embryonální kmenové buňky (ES) jsou embryonální buňky během embryonálního vývoje, které mohou být uměle kultivovány a proliferovány a mají funkci diferenciace na jiné typy buněk.Kultivace ES buněk: Vnitřní buněčná hmota blastocysty se izoluje a kultivuje.Když je ES kultivován ve vrstvě bez vyživovače, bude se diferencovat na různé funkční buňky, jako jsou svalové buňky a N buňky.Při kultivaci v médiu obsahujícím fibroblasty si ES zachová funkci diferenciace.ES může být geneticky manipulováno a jeho diferenciační funkce může být integrována bez ovlivnění jeho diferenciační funkce, což řeší problém náhodné integrace.Zaveďte exogenní geny do embryonálních kmenových buněk, poté je implantujte do dělohy březích myších samic, vyviňte se v mláďata a křížením získáte homozygotní myši.
