1. Prvotní porozumění

V této fázi musíme porozumět některým pojmům a terminologii, abychom se vyvarovali chyb před našimi seniory, jako například:

Otázka: Jaký je rozdíl mezi RT-PCR, qPCR, PCR v reálném čase a RT-PCR v reálném čase?

Odpověď: RT-PCR je reverzní transkripční PCR(reverzní transkripční PCR, RT-PCR), což je široce používaná varianta polymerázové řetězové reakce (PCR).V RT-PCR je řetězec RNA reverzně transkribován do komplementární DNA, která se pak používá jako templát pro amplifikaci DNA pomocí PCR.
Real-time-PCR a qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) jsou to samé, obě jsou kvantitativní PCR v reálném čase, což znamená, že každý cyklus PCR má záznamy dat v reálném čase, takže počet výchozích šablon lze upravit přesnou analýzou.

Ačkoli se zdá, že jak Real-time PCR (real-time fluorescenční kvantitativní PCR), tak reverzní transkripční PCR (reverzní transkripční PCR) jsou zkráceny jako RT-PCR, mezinárodní konvence zní: RT-PCR konkrétně odkazuje na reverzní transkripciPCR , Real-time PCR je obecně zkráceno jako qPCR (kvantitativní real-time PCR).

A RT-PCR v reálném čase (RT-qPCR), je to reverzní transkripční PCR kombinovaná s fluorescenční kvantitativní technologií: nejprve získejte cDNA (RT) z reverzní transkripce RNA a poté použijte Real-time PCR pro kvantitativní analýzu (qPCR).Většina laboratoří dělá RT-qPCR, tedy výzkum down-regulace exprese RNA, takže qPCR, o které všichni v laboratoři mluví, ve skutečnosti odkazuje na RT-qPCR, ale nezapomínejte, že v klinických aplikacích je stále mnoho testů DNA.Kvantitativní analýza, jako je detekce HBV viru hepatitidy B.

Otázka: Proč by po přečtení velkého množství fluorescenční kvantitativní PCR měl být amplifikovaný fragment kontrolován v rozsahu 80-300 bp?

Odpovědět: Délka každé genové sekvence je různá, některé jsou několik kb, jiné stovky bp, ale při navrhování primerů potřebujeme pouze délku produktu 80-300 bp, příliš krátké nebo příliš dlouhé nejsou vhodné pro fluorescenční kvantitativní PCR detekci.Fragment produktu je příliš krátký na to, aby byl odlišen od primer-dimeru.Délka primer-dimer je přibližně 30-40 bp a je obtížné rozlišit, zda se jedná o primer-dimer nebo produkt, pokud je menší než 80 bp.Pokud je fragment produktu příliš dlouhý, přesahuje 300 bp, snadno to povede k nízké účinnosti amplifikace a nemůže účinně detekovat množství genu.

Když například spočítáte, kolik lidí je ve třídě, stačí spočítat, kolik tam je úst.Totéž platí, když detekujete geny, potřebujete pouze detekovat určitou sekvenci genu, který bude reprezentovat celou sekvenci.Pokud chcete počítat lidi, musíte počítat jak ústa, tak nos, uši a brýle, a je snadné dělat chyby.

Abychom to rozšířili, v biologickém výzkumu existuje mnoho výzkumných případů z bodu do oblasti, protože genová sekvence jakéhokoli druhu je velmi dlouhá, je zbytečné a nemožné měřit všechny fragmenty, jako je sekvenování bakteriálního 16S, což je provedení konzervativní sekvence bakterií Testy k odvození počtu určité populace bakterií.

Otázka: Jaká je optimální délka pro návrh primeru qPCR?

Odpovědět: Obecně řečeno, délka primeru je asi 20-24 bp, což je lepší.Samozřejmě musíme při návrhu primeru věnovat pozornost hodnotě TM primeru, protože ta souvisí s optimální teplotou žíhání.Po mnoha experimentech se ukázalo, že 60°C je lepší hodnota TM.Pokud je teplota žíhání příliš nízká, snadno to povede k nespecifické amplifikaci.Pokud je teplota žíhání příliš vysoká, účinnost zesílení bude relativně nízká, vrchol křivky zesílení začne později a hodnota CT bude zpožděna.

Otázka: Jak se liší metoda barvení od metody sondy?

Odpověď: Barvivá metodaNěkterá fluorescenční barviva, jako je SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO atd., sama o sobě světlo nevyzařují, ale po navázání na menší žlábek dvouvláknové DNA budou emitovat fluorescenci.Na začátku PCR reakce tedy přístroj nemůže detekovat fluorescenční signál.Když reakce dosáhne stadia žíhání-prodlužování, otevře se dvouvlákno a nové vlákno se syntetizuje působením DNA polymerázy a fluorescenční molekula se naváže na vedlejší žlábek dsDNA.S rostoucím počtem cyklů PCR se stále více barviv kombinuje s dvouvláknovou DNA a fluorescenční signál se také neustále zvyšuje.Metoda barviva se používá především ve vědeckém výzkumu.
PS: Při provádění experimentu buďte opatrní, barvivo musí být kombinováno s lidskou DNA, dejte pozor, abyste z ní udělali fluorescenční osobu.

Metoda barviva (vlevo) Metoda sondy (vpravo)
PS: Při provádění experimentu buďte opatrní, barvivo musí být kombinováno s lidskou DNA, dejte pozor, abyste z ní udělali fluorescenční osobu.

SYBR Green Ⅰ se váže na vedlejší drážku DNA

Metoda sondyTaqmanova sonda je nejběžněji používanou hydrolyzační sondou.Na 5′ konci sondy je fluorescenční skupina, obvykle FAM, a samotná sonda je sekvence komplementární k cílovému genu.Na 3' konci je fluorescenční zhášecí skupina.Podle principu přenosu fluorescenční rezonanční energie (Försterův rezonanční přenos energie, FRET), když reportérová fluorescenční skupina (donorová fluorescenční molekula) a zhášecí fluorescenční skupina (akceptorová fluorescenční molekula) jsou excitovány Když se spektra překrývají a vzdálenost je velmi blízko (7-10nm), může excitace donorové molekuly indukovat autofluorescenci, zatímco akceptovaná molekula fluorescence.Proto na začátku PCR reakce, když je sonda volná a neporušená v systému, reportérová fluorescenční skupina nebude emitovat fluorescenci.Při nasedání se primer a sonda navážou na templát.Během fáze extenze polymeráza nepřetržitě syntetizuje nové řetězce.DNA polymeráza má 5′-3′ exonukleázovou aktivitu.Když DNA polymeráza dosáhne sondy, hydrolyzuje sondu z templátu, oddělí reportérovou fluorescenční skupinu od zhášecí fluorescenční skupiny a uvolní fluorescenční signál.Protože mezi sondou a templátem existuje vztah jedna ku jedné, metoda sondy je lepší než metoda barviva, pokud jde o přesnost a citlivost testu.Metoda sondy se používá především v diagnostice.

Otázka: Co je absolutní kvantifikace?Co je to relativní kvantifikace?

Odpovědět: Absolutní kvantifikace se týká výpočtu počátečního počtu kopií vzorku, který má být testován pomocí qPCR, například kolik virů HBV je v 1 ml krve.Výsledek získaný relativní kvantifikací je změna v množství cílového genu ve specifickém vzorku vzhledem k jinému referenčnímu vzorku a exprese genu je up-regulována nebo down-regulována.

Otázka: Ovlivní množství extrakce RNA, účinnost reverzní transkripce a účinnost amplifikace výsledky experimentu?
Otázka: Ovlivní skladování vzorků, extrakční činidla, činidla pro reverzní transkripci a světlo propouštějící spotřební materiál výsledky experimentu?
Otázka: Jaká metoda může opravit experimentální data?

Pokud jde o tyto problémy, podrobně je popíšeme v části pro pokročilé a pokročilé níže.
2. Pokročilé znalosti

Pokud jde o fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase, musíme si uvědomit skutečnost, že každý rok jsou publikovány tisíce vědeckých výzkumů, mezi nimiž technologie fluorescenční kvantitativní PCR není malé množství.

Pokud neexistuje společný standard pro měření fluorescenčního kvantitativního PCR experimentu, výsledky se mohou značně lišit.Pro stejný gen stejného druhu a stejnou metodou zpracování se budou výsledky detekce také značně lišit a pro opozdilce bude obtížné opakovat stejné výsledky.Nikdo neví, co je správné a co špatné.

Znamená to, že fluorescenční kvantitativní PCR je podvodná nebo nespolehlivá technologie?Ne, je to proto, že fluorescenční kvantitativní PCR je citlivější a přesnější a trochu nesprávná operace poskytne zcela opačné výsledky.Malá ztráta je tisíc mil daleko.Autor článku může být recenzenty opakovaně mučen.Recenzenti časopisu si zároveň těžko vybírají z různých experimentálních výsledků.

Celkově vzato to ukazuje na nedostatek konsenzu v experimentech PCR v reálném čase.Za tímto účelem začali starší vědci v oboru formulovat standardy,požadující, aby přispěvatelé poskytli některé nezbytné experimentální podrobnosti a podrobnosti o zpracování dat (včetně nezbytných údajů) v článku, aby byly splněny tyto normy.

Recenzenti mohou posoudit kvalitu experimentu čtením těchto podrobností;budoucí čtenáři toho mohou také využít k opakování experimentu nebo k vylepšení experimentu.Pak jsou takto získané experimentální výsledky plné informací, kvalitní a použitelné.

MIBBI (Minimální informace pro biologická a biomedicínská vyšetřování -http://www.mibbi.org) vznikl.MIBBI je projekt, který poskytuje standardy pro experimenty.Vychází v přírodě.Tento projekt je zaměřen na různé biologické experimenty, včetně buněčné biologie, Microarray, qPCR, o kterých nyní budeme diskutovat atd., a zajišťuje pro každý typ experimentu při předkládání rukopisů.Tyto informace by měly být poskytovány vždy.

V projektu MIBBI existují dva články týkající se fluorescenční kvantitativní PCR, a to:
·RDML (Real-Time PCR Data Markup Language) – strukturovaný jazyk a průvodce hlášením pro kvantitativní PCR data v reálném čase;
·MIQE (Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments) – minimum informací pro publikování článků o kvantitativních PCR experimentech v reálném čase.
Nejprve si promluvme o RDML, specifikaci terminologie.

Pokud neexistuje standardní definice pro vše, nelze pokračovat v diskusi, proto je vysvětlení pojmů u zkoušky tak důležité.
Terminologie použitá ve fluorescenčním kvantitativním PCR experimentu zahrnuje následující obsah.QIAGEN pro nás připravil to nejlepší shrnutí.Následující jsou všechny suchézboží .

Amplifikační křivka
Amplifikační křivka se týká křivky vytvořené během procesu PCR, přičemž číslo cyklu je na vodorovné ose a intenzita fluorescence v reálném čase během reakce je na ose y.

Vynikající křivka zesílení by měla mít následující vlastnosti: základní linie je plochá nebo mírně snížená a není zde patrný vzestupný trend;inflexní bod křivky je jasný a sklon exponenciální fáze je úměrný účinnosti zesílení.Čím větší je sklon, tím vyšší je účinnost zesílení;celková křivka zesílení Rovnoběžnost je dobrá, což naznačuje, že účinnost zesílení každé trubice je podobná;exponenciální fáze amplifikační křivky vzorků s nízkou koncentrací je zřejmá.

základní linie (základní linie)
Základní čára je hladina hluku raného cyklu, obvykle měřeno mezi 3. a 15. cyklem, protože zvýšení hodnoty fluorescence způsobené amplifikačním produktem nelze během tohoto období detekovat.Počet cyklů použitých k výpočtu základní linie se může měnit a může být nutné jej snížit, pokud se použije vysoká množství templátu nebo pokud je úroveň exprese cílového genu vysoká.

Nastavení základní linie vyžaduje zobrazení údajů o fluorescenci z křivky amplifikace linearity.Základní linie je nastavena tak, že růst amplifikační křivky začíná číslem cyklu větším, než je nejvyšší číslo cyklu základní linie.Základní linie je třeba nastavit individuálně pro každou cílovou sekvenci.Průměrné hodnoty fluorescence detekované v časných cyklech je třeba odečíst od hodnot fluorescence získaných v amplifikovaných produktech.Nejnovější verze různých Real-Time PCR software umožňují automatickou optimalizaci základního nastavení pro jednotlivé vzorky.

Během prvních několika cyklů amplifikační reakce PCR se fluorescenční signál příliš nemění.Přiblížení k přímce se nazývá základní linie, ale když se podíváme pozorně na prvních několik cyklů, vidíme, že uvnitř základní linie je to, co se děje na obrázku níže.

Pozadí Pozadí odkazuje na
nespecifická hodnota fluorescence v reakci.Například: neúčinné zhášení fluorescence;nebo velký počet templátů dvouřetězcové DNA díky použití SYBR Green.Složky pozadí signálu jsou matematicky odstraněny softwarovým algoritmem Real-Time PCR.

Signál reportéra
Reportérový signál označuje fluorescenční signál generovaný SYBR Green nebo fluorescenčně značenými sekvenčně specifickými sondami během Real-Time PCR.

Normalizovaný reportérský signál (RN)
RN označuje intenzitu fluorescence reportérového barviva dělenou intenzitou fluorescence pasivního referenčního barviva měřenou v každém cyklu.

Pasivní referenční barvivo
V některých real-time PCR,fluorescenční barvivo ROX se používá jako vnitřní reference pro normalizaci fluorescenčního signálu.Koriguje odchylky způsobené nepřesným pipetováním, polohou jamek a fluktuacemi fluorescence u jednotlivých jamek.

Práh fluorescence (práh)
byla upravena nad hodnotu pozadí a významně pod hodnotu plató amplifikační křivky.Musí ležet v lineární oblasti amplifikační křivky, představující logaritmicko-lineární rozsah detekce PCR.Prahové hodnoty by měly být nastaveny v zobrazení log-amplifikační křivky tak, aby log-lineární fáze PCR byla snadno identifikovatelná.Pokud je v Real-Time PCR více cílových genů, musí být pro každý cíl nastaven práh.Obecně se jako signál fluorescenčního pozadí používá fluorescenční signál prvních 15 cyklů PCR reakce a práh fluorescence je 10násobek standardní odchylky fluorescenčního signálu prvních 3 až 15 cyklů PCR a práh fluorescence se nastavuje v exponenciální fázi amplifikace PCR.Obecně má každý přístroj před použitím nastaven práh fluorescence.

Práh cyklu (CT) nebo Crossing Point (CP)
Cyklus, ve kterém amplifikační křivka překročí práh (tj. bod, ve kterém se významně zvyšuje detekce fluorescence).CT může být zlomek a lze vypočítat množství výchozí šablony.Hodnota CT představuje počet cyklů, kdy fluorescenční signál v každé zkumavce PCR dosáhne nastavené prahové hodnoty.Mezi hodnotou CT každé šablony a logaritmem počátečního čísla kopie šablony je lineární vztah.čím vyšší je počáteční počet kopií, tím menší je hodnota CT a naopak.Standardní křivka může být vytvořena pomocí standardu se známým počátečním počtem kopií, kde úsečka představuje hodnotu CT a ordináta představuje logaritmus počátečního počtu kopií.Proto, pokud je získána hodnota CT neznámého vzorku, lze počáteční počet kopií vzorku vypočítat ze standardní křivky.

Hodnota ΔCT
Hodnota ΔCT popisujerozdíl mezi cílovým genem a odpovídající hodnotou CT endogenního referenčního genu, jako je housekeeping gen, a používá se k normalizaci množství použitého templátu:
⇒ΔCT = CT (cílový gen) – CT (endogenní referenční gen)

Hodnota ΔΔCT
Hodnota AACT popisuje rozdíl mezi průměrnou hodnotou AACT vzorku, který je středem zájmu (např. stimulované buňky) a průměrnou hodnotou ΔACT referenčního vzorku (např. nestimulované buňky).Referenční vzorek se také nazývá kalibrační vzorek a všechny ostatní vzorky jsou na něj normalizovány pro relativní kvantifikaci:
⇒ΔΔCT = průměrná ΔCT (zájmový vzorek) – průměrná ΔCT (referenční vzorek)

Endogenní referenční geny (endogenní referenční geny)
Hladiny exprese endogenních referenčních genů, jako jsou provozní geny (geny pro údržbu), se mezi vzorky neliší.Porovnání hodnot CT referenčního genu s cílovým genem umožňuje normalizaci úrovně exprese cílového genu na množství vstupní RNA nebo cDNA (viz část o hodnotách ΔCT výše).

Správné vnitřní referenční genymožná degradace RNA nebo přítomnost enzymových inhibitorů ve vzorcích RNA, stejně jako variace v obsahu RNA, účinnosti reverzní transkripce, obnově nukleové kyseliny a manipulaci se vzorky.Abychom vybrali optimální referenční gen (geny), upravili jsme algoritmus tak, aby umožňoval výběr optimální reference v závislosti na experimentálním nastavení.

Interní kontrola
Kontrolní sekvence, která je amplifikována ve stejné reakci jako cílová sekvence a sondována jinou sondou (tj. prováděním duplexní PCR).Interní kontroly se často používají k vyloučení neúspěšných amplifikace, například když není detekována cílová sekvence.
Kalibrační vzorek
Referenční vzorek (například purifikovaná RNA z buněčné linie nebo tkáně) použitý v relativní kvantifikaci k porovnání všech ostatních vzorků ke stanovení relativní úrovně exprese genu.Kalibračním vzorkem může být jakýkoli vzorek, ale obvykle se jedná o kontrolu (například neošetřený vzorek nebo vzorek z času nula experimentu).

Pozitivní kontroly
používat kontrolní reakce sznámé množství šablony.Pozitivní kontroly se často používají ke kontrole, zda sada primerů nebo sada primer-sonda funguje správně a že reakce je nastavena správně.

Žádná kontrola šablon (NTC)
Kontrolní reakce, která obsahuje všechny potřebné složky amplifikační reakce kromě templátu, který se obvykle nahrazuje vodou.Použití NTC může najít kontaminaci způsobenou kontaminací reagencií nebo cizí DNA, a tím zajistit autenticitu a spolehlivost detekčních dat.Zesílení kontroly NTC indikuje kontaminaci.

Žádná kontrola RT (NRT)
Proces extrakce RNA může obsahovat reziduální genomickou DNA, která je extrémně škodlivá a je viníkem ovlivňujícím kvalitu dat a přirozeným nepřítelem qPCR, takže při navrhování experimentů musí být navržen tak, aby pouze amplifikoval detekci RNA.Existují dva způsoby, jeden je navrhnout primery napříč introny, druhý je úplně odstranit DNA, který je lepší, o čemž bude řeč později.NTR kontrola je magické zrcadlo pro detekci znečištění DNA.Pokud dojde k zesílení, znamená to, že dochází ke znečištění.

Normy
Standardy jsou vzorky o známé koncentraci nebo počtu kopií, které se používají ke konstrukci standardní křivky.Aby se zajistila stabilita standardu, genový fragment se obvykle klonuje do plazmidu a používá se jako standard.

Standardní křivka
se obvykle ředí do alespoň 5 koncentračních gradientů se standardním produktem podle poměru zdvojení a 5 bodů je nakresleno v souřadnicích hodnoty CT a počtu kopií a body jsou spojeny tak, aby vytvořily čáru pro vytvoření standardní křivky.U každé standardní křivky je třeba zkontrolovat její platnost.Hodnota sklonu se pohybuje mezi –3,3 a –3,8 a každá koncentrace se provede trojmo.Body, které se výrazně liší od ostatních bodů, by měly být vyřazeny.Hodnota CT vzorku, který má být testován, se přenese do standardní křivky a lze vypočítat hladinu exprese vzorku, který má být testován.

Hodnota CT vzorku, který má být testován, se přenese do standardní křivky a lze vypočítat počáteční počet kopií vzorku, který má být testován.

Účinnost a sklon
Sklon standardní křivky představuje účinnost PCR v reálném čase.
·Sklon -3,322 znamená, že účinnost amplifikace PCR je 1 nebo 100 % účinná a množství produktu PCR se v každém cyklu zdvojnásobí.
·Sklon menší než –3,322 (např. –3,8) indikuje účinnost PCR
·Sklon větší než –3,322 (např. –3,0) naznačuje, že účinnost PCR se zdá být vyšší než 100 %, což je zvláštní, jak by jeden cyklus PCR mohl generovat více než dvojnásobek amplifikovaného produktu?Tato situace nastává v nelineární fázi PCR reakce, to znamená, že dochází k velkému množství nespecifické amplifikace.

křivka tání
Po dokončení amplifikace qPCR se produkt PCR zahřeje.Jak teplota stoupá, dvouvláknový amplifikační produkt postupně taje, což má za následek pokles intenzity fluorescence.Při dosažení určité teploty (Tm) se roztaví velké množství produktů.Fluorescence prudce klesá.Různé produkty PCR mají různé hodnoty Tm a různé teploty tání, takže lze identifikovat specificitu PCR.

Křivka tání (odvozená křivka)
Křivka tání je odvozena tak, aby vytvořila mapu píku, která může intuitivněji zobrazit situaci fragmentů produktu PCR.Protože teplota tání je hodnota Tm fragmentu DNA, lze posuzovat některé parametry, které ovlivňují hodnotu Tm fragmentu DNA, jako je velikost fragmentu, obsah GC atd. Obecně řečeno, podle našich zásad návrhu primeru,délka amplifikovaného produktu je v rozmezí 80-300 bp, takže teplota tání by měla být mezi 80 °C a 90 °C.

Interpretace křivky tání: Pokud se jediný hlavní pík objeví mezi 80°C-90°C, znamená to, že fluorescenční kvantitativní PCR je perfektní;pokud se hlavní pík objeví mezi 80 °C-90 °C a různé píky se objeví pod 80 °C, je v zásadě uvažován dimer primeru.Chcete-li to vyřešit, můžete zkusit zvýšit teplotu žíhání;pokud se hlavní pík objeví mezi 80°C-90°C a různorodý pík se objeví znovu, když teplota stoupne, v zásadě se má za to, že došlo ke kontaminaci DNA a DNA je třeba odstranit v počáteční fázi experimentu.

Samozřejmě stále existují některé abnormální situace, které budou níže rozebrány jedna po druhé.
3. Pokročilé znalosti

Abych provedl qPCR, musím říct MIQE,Minimální informacepro zveřejněníKvantitativníPCR v reálném časeExperimenty — minimum informací pro publikování článků o kvantitativní PCR v reálném časeexperimenty .Abychom všem usnadnili pochopení, zjednodušíme hlavní obsah.

Původní text MIQE můžete vyhledat na internetu a nejdůležitější je, že stanovíkontrolní seznam údajů, který je třeba poskytnout při publikování článku .

Recenzenti mohou posoudit kvalitu experimentu čtením těchto podrobností;budoucí čtenáři to mohou také použít k opakování nebo vylepšení experimentu.
Stojí za zmínku, že v tomto seznamu je důležitost každého seznamu označena E nebo D.Co to znamená?E: základní informace (musí být předloženy);D: žádoucí informace (poskytněte co nejvíce).

MIQE (1) — Experimentální design
Mnoho šmejdů, kteří po ukončení postgraduálního studia dokončili obhajobu, nebude vědět, jak samostatně navrhnout experiment, otevřít sešity a udělat to, co jim učitel řekne.Výsledkem bylo, že experimentální návrh nebyl přísný a redakce časopisu řekla, že chtějí vymyslet tento a ten obrázek, takže to udělali jako omámení.Takhle se dělají šmejdi!

Blíže k domovu je prvním principem experimentu určenípřísnost experimentální logiky.Nejzásadnější je návrh experimentu a na návrhu experimentu je nejdůležitější, jak nastavit cílový vzorek, referenční vzorek (kontrolu) a počet opakování, aby byla experimentální data referenční, srovnatelná a přesvědčivá.

Cílový vzorekse týká vzorku, který vyžaduje, abychom po určité léčbě detekovali cílový gen.Referenční vzorekje vzorek bez jakékoli úpravy, který je v biologii často označován jako divoký typ.

Experimentální replikacejsou velmi důležité.Obecně platí, že počet přesvědčivých replikací musí být větší než tři.Je třeba rozlišovat, co je biologická replikace a co technická replikace.

Biologické replikáty: Stejný ověřovací experiment provedený s různými materiály (čas, rostliny, šarže, reakční desky).

Biologická duplikace
Vezměme si jako příklad ošetření pepře pesticidy.Chceme nastříkat pesticidy na tři rostliny ABC, pak tři rostliny ABC jsou tři biologické replikáty a jsou to stejné ověřovací experimenty provedené s různými materiály.Ale jako experiment je určitě potřeba kontrola, takže můžeme postřikovat jednu z větví rostliny A, abychom vytvořili experimentální skupinu rostliny A, a nestříkat ostatní větve rostliny A, abychom vytvořili kontrolní skupinu.Udělejte totéž pro B a C.

Technické repliky (technické repliky): Jedná se o opakovaný experiment navržený tak, aby se zabránilo chybám způsobeným provozem, což je ve skutečnosti duplicitní otvor obsažený ve stejném materiálu.Jak ošetření, tak kontrola musí mít nastavení replikace (minimálně tři) cílového genu a interního referenčního genu.

Technické opakování
Jako příklad si vezměte opět pepř ošetřený pesticidy.Pro experimentální skupinu rostliny A jsme vytvořili tři PCR díry 1, 2 a 3 pro její cílový gen a vnitřní referenční gen, abychom získali průměr po detekci.Pro kontrolu rostlin se skupinami A také zachází stejným způsobem.Podobně proveďte stejné ošetření pro rostliny B a C.Toto je technické opakování.

To stojí za zmínkuto, co vstupuje do statistiky, je biologické opakování a technické opakování má testovat, zda v experimentálním procesu nejsou nějaké náhodné jevy, aby byly výsledky experimentu důvěryhodné, to znamená, aby se předešlo chybám tím, že vezmeme jejich průměr, jak často říkáme.

Negativní kontroly – NTC a NRT
NTC (kontrola bez šablony), kontrola bez šablony, se používá k ověření, zda je experimentální materiál kontaminován.Obecně se jako šablona používá voda.Pokud dojde k fluorescenční reakci, znamená to, že v laboratoři došlo ke kontaminaci nukleovými kyselinami.

Tato znečištění pocházejí z: nečisté vody, nekvalifikovaných činidel obsahujících endogenní DNA, znečištění primery, znečištění laboratorního zařízení, znečištění aerosoly atd., je třeba používat lapače RNázy a inhibitory RNázy.Znečištění aerosolem je nejobtížnější najít.Představte si, že vaše laboratoř je jako smog s různými nukleovými kyselinami suspendovanými ve vzduchu.

NRT (No-Reverse Transkriptase), kontrola bez reverzní transkripce, je nereverzně transkribovaná RNA jako negativní kontrola, což je kontrola zbytku gDNA.

Při genové expresi je množství RNA detekováno detekcí množství cDNA po reverzní transkripci.Pokud při purifikaci RNA existuje zbytek gDNA, způsobí to chyby v experimentálních výsledcích, protože skutečné získané výsledky jsou gDNA a cDNA.Na agregované úrovni, nejen cDNA, musí být gDNA během extrakce RNA zcela odstraněna.

MIQE (2) — ukázkové informace
Takzvané vzorové informace znamená, že když publikujeme článek o qPCR, musíme vzorové informace srozumitelně vysvětlit, což je nepostradatelná součást článku.Podobně, když zpracováváme vzorky, musíme také regulovat naše vlastní operace, abychom zajistili platnost vzorků.

Popis vzorku je pouze výsledkem a během celého experimentu bychom měli věnovat větší pozornost pořízeným materiálům.

Výběr experimentálních materiálů
Vzorky krve – vyberte čerstvou krev, ne více než 4 hodiny.Vzorky buněk – zvolte odběr čerstvých buněk v období energického růstu.Živočišná tkáň—Vyberte čerstvou, energicky rostoucí tkáň.Rostlinná tkáň – Vyberte si čerstvou, mladou tkáň.

Určitě jste si všimli, že v těchto pár větách je klíčové slovo: čerstvý .
Pro výše uvedené vzorky je nejlepší, cenově výhodná a stabilní souprava na trhu souprava Foregene, která dokáže rychle a snadno extrahovat jejich DNA a RNA.

Mini sada krve DNA

Souprava pro izolaci buněčné celkové RNA

Animal Total RNA Isolation Kit

Plant Total RNA Isolation Kit

Plant Total RNA Isolation Kit Plus

Sada pro izolaci rostlinné DNA

Skladování experimentálních materiálů
Obecně řečeno nedoporučujeme vzorky skladovat, pokud to podmínky dovolují.Existuje však mnoho přátel, kteří nemohou provádět experimenty bezprostředně po odběru vzorků, a někteří dokonce potřebují nosit nádrže s tekutým dusíkem na pole pro odběr vzorků.

Pro tento druh pracovitého přítele mohu jen říci, že nerozumíte spotřebnímu materiálu pro činidla.Nyní mnoho výrobců spotřebních činidel vyrábí činidla, která mohou uchovávat vzorky RNA při pokojové teplotě, a vy si je můžete vybrat.Konvenční metodou skladování je skladování kapalného dusíku pomocí malé nádrže na kapalný dusík, která se snadno přenáší.Po přivezení vzorku zpět do laboratoře jej uchovávejte v chladničce -80°C.

U experimentů zahrnujících RNA je třeba dodržet zásadu šesti slov:nízká teplota, žádné enzymy,arychle .

Koncept nízké teploty je snadno pochopitelný;bez enzymů je RNáza všude na světě, ve kterém žijeme (jinak by vás zabil HIV), takže jak se vyhnout RNáze při provádění experimentů, je velmi důležitý koncept;rychle,Na světě není žádné Kung Fu, které by se nedalo zlomit, pouze rychlost se nedá zlomit.

Proto v jistém smyslu čím kratší doba extrakce, tím lepší souprava.Proč ano?Foregene's kit kladou důraz na rychlost, protože ji dobře znají.

PS: Některé dívky dělají experimenty velmi pečlivě, ale po několika letech práce nejsou tak dobré jako slam dunk.Mají pocit, že Bůh je nespravedlivý, stěžuje si na druhé a hledá život.Ve skutečnosti to nechápala.Nechránil dobře RNA a hráč slam dunk byl hbitý.Když dělal experiment, myslel si, že dokončí slam dunk s třikrát, pětkrát a dvěma divizemi, ale experiment udělal dobře.

Poznámka: Pomalejší, větší šance na invazi RNázy.Jak se vycvičit, abyste byli rychlí?Neexistuje žádný způsob, jen více cvičit.

Pro různé experimenty a různé vzorky je stále nutné číst další literaturu a zvolit vhodnou metodu zpracování.Pro proces sběru a uchovávání vzorků MIQE vyžaduje, aby to bylo jasně napsáno v papíru, aby recenzenti mohli zkontrolovat spolehlivost papíru, a pro ohromené mladé lidi je také vhodné váš experiment zopakovat.

I když jsou biologické experimenty obtížné, jsou špičkové.Pokud si nedáte pozor, můžete převrátit svět.Například proměnit SARS v biochemickou krizi nebo vyrobit hybridní rýži, aby se zachránilo 1,3 miliardy lidí.Obrázek níže je chemický experiment, měli byste pochopit, jak jste hrdí na svůj výzkum, jen když se podíváte na jeho péro-jako vzhled.Zapomeň na to, neočerň ho.

MIQE (3) – extrakce nukleové kyseliny.
Extrakce nukleových kyselin je velká událost a všechny molekulárně biologické experimenty začínají extrakcí nukleové kyseliny.Nejprve zkopírujme obsah MIQE o extrakci nukleové kyseliny.

Při pohledu na tuto formu nemůžete zůstat na povrchu.Forma je dogma.Chcete-li být nejlepším studentem, musíte se zeptat proč.Podstatným obsahem této tabulky je: Pronásledováníčistota, integrita, konzistence a extrakční množství RNA .

První částProces nebo nástroj je krok extrakce nukleové kyseliny.Pokud k extrakci používáte automatický extraktor nukleových kyselin (pro pokročilé, pro nákup mě prosím kontaktujte), musíte uvést název modelu přístroje.

Název stavebnice a

jaká souprava byla použita pro detaily změny, jaká speciální činidla byla přidána nebo jaké speciální operace byly provedeny, by mělo být jasně vysvětleno, aby ostatní mohli váš experiment snadno zopakovat.

Někteří lidé přidávají při extrakci speciálních vzorků nějaké speciální reagencie v domnění, že je to jejich tajná zbraň, a neříkají to ostatním.Zatímco to drží v tajnosti, ztrácejí také možnost, aby váš článek zazářil.Nebuď chytrý, musíš být ve vědeckém výzkumu poctivější než ten venkovský starý Zhang, pokud chceš být chytrý, článek z tebe udělá hlupáka.

musí si pamatovat produktové číslo sadykdyž si objednáte sadu a napíšete článek.Na soupravě jsou obecně dvě čísla: Cat – katalogové číslo (číslo produktu, číslo výrobku), Lot – číslo šarže produktu ( Používá se k označení šarže produktu).

Číslo CAS se navíc často používá při objednávání biochemických činidel a budu ho společně popularizovat.Číslo CAS je číslo přidělené Americkou chemickou společností každému novému chemickému léku.Obecně jsou tři čísla spojena pomlčkou.Rushuiovo číslo CAS: 7732-18-5.Chemikálie mají často více aliasů, ale číslo CAS je jedinečné.Při objednávání léku si nejprve zkontrolujte jeho CAS číslo.

Blíže k domovu, proč musíme tyto věci jasně popisovat?Ve skutečnosti jde také o kontrolu kvality extrakce RNA.Použitím nástrojů a souprav bude extrakce RNA konzistentnější.Rozsah extrakce v běžných laboratořích není velký a lze jej získat pomocí souprav.

Podrobnosti o léčbě DNázou nebo RNázou
Důležitým problémem fluorescenční kvantitativní PCR je zabránit kontaminaci DNA a neexperimentovat, pokud dojde ke kontaminaci.Proto je bezpodmínečně nutné uvést proces, který jste použili ke zpracování DNA, abyste prokázali, že DNA v experimentálním procesu byla zcela a úplně odstraněna.znázorněno schematickým diagramem.

Schématický diagram RNA a DNA
Obecně je metodou odstranění DNA ošetření RNA DNázou po extrakci.Jedná se však o poměrně staré metody.Komerční soupravy pro extrakci RNA byly schopny odstranit DNA během procesu extrakce bez přidání DNázy.Například série stavebnic od Foregene.

Poznámka: Odstranění DNA při extrakci RNA je velmi nebezpečný dvousečný meč, který prodlouží dobu operace extrakce RNA a zvýší riziko degradace RNA.V podstatě jde o kompromis mezi výtěžkem RNA a čistotou.

Navíc množství DNázy přidané do adsorpční kolony na bázi oxidu křemičitého je velmi malé a k dosažení účinku je nutné použít vysoce kvalitní DNázu.Neoptimalizovanou DNázu nelze trávit rychle a úplně.Jedná se o test technické úrovně obchodníka.Samozřejmě existují ještě podivnější obchodníci, kteří se chlubí, že DNA lze odstranit i bez DNázy.Dá se říci, že každý, kdo se chlubí, že DNA lze zcela odstranit bez DNázy, je chuligán.DNA je relativně stabilní dvouvláknová struktura a nelze ji vymazat pouhým mluvením a smíchem.

Hodnocení kontaminace
metoda hodnocení: detekce elektroforézou, 1% agaróza, 6V/cm, 15min, zatížení 1-3 ul

Kvantitativní analýza nukleových kyselin
se obvykle měří pomocí UV spektrofotometru.Dovolte mi nejprve popularizovat význam tří hodnot OD260, OD280 a OD230.
·OD260nm: Je to absorpční vlnová délka nejvyššího absorpčního píku nukleové kyseliny a nejlepší naměřená hodnota se pohybuje od 0,1 do 1,0.Pokud ne, nařeďte nebo koncentrujte vzorek, aby byl v rozmezí.
·OD280nm: Je to absorpční vlnová délka nejvyššího absorpčního vrcholu bílkovin a fenolických látek.
·OD230nm: Je to absorpční vlnová délka nejvyššího absorpčního vrcholu sacharidů.

Dále si promluvme o roli každého indikátoru.Pro A260 může být použit k měření výtěžku nukleové kyseliny.Když OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.

Pro čistotu se musíme podívat na poměry, které běžně vidíme: OD260/280 a OD260/230.
· Čistá DNA: OD260/280 se přibližně rovná 1,8.Když je větší než 1,9, znamená to znečištění RNA, a když je menší než 1,6, znamená to znečištění proteiny a fenoly.
· Čistá RNA: 1,7
·OD260/230: Ať se jedná o DNA nebo RNA, referenční hodnota je 2,5.Pokud je nižší než 2,0, znamená to, že došlo ke znečištění cukrem, solí a organickou hmotou.

Integrita RNA

Je velmi důležité měřit integritu RNA.Obecně je nutné provést experiment denaturačního gelu RNA, aby se ověřilo, zda je jas mezi 28S a 18S RNA dvojnásobný vztah.Když se objeví třetí pruh 5S, znamená to, že RNA začala degradovat, s výjimkou bezobratlých.

Data pro hodnocení kvality RNA: Kromě výše uvedených testů existují také některé pokročilejší přístrojové testy z hlediska integrity RNA, jako je test integrity RQI systému automatické elektroforézy Experion, který dokáže detekovat, zda je RNA degradována neviditelně.

Ve vědeckém výzkumu je fluorescenční kvantitativní PCR srovnáním mezi cílovým genem a interním referenčním genem.Proto je v procesu uchovávání vzorku RNA, extrakce RNA atd. primárním cílem zajistit integritu RNA.

Jak integrita RNA ovlivňuje rovnováhu mezi cílovým genem a interním referenčním genem, lze snadno pochopit z obrázku níže.Degradace povede k nekompletnosti genu, ať už se jedná o nekompletnost interního referenčního genu nebo nekompletnost cílového genu, bude mít velký dopad na data.

Schematický diagram cílového genu a referenčního genu nesmí být pravdivý

Inhibiční test (zda je hodnota CT potlačena při vysoké nebo nízké koncentraci nebo za jiných podmínek)

Vezmeme-li tento obrázek jako příklad, hodnoty Ct pěti křivek jsou následující.Rozložení hodnot CT mezi křivkami je nerovnoměrné a hodnoty Ct jsou zpožděné při vysokých a nízkých koncentracích, což je případ inhibice PCR.

Klíčový bod: V procesu extrakce RNA se musíme vzdát mylných představ a zavést ty správné.

Špatná myšlenka je: extrakce RNA sleduje pouze výtěžek, přičemž si myslí, že čím větší množství získané RNA, tím lépe.Ve skutečnosti, když provádíme kvantifikaci, pokud počet genů není příliš velký, nepotřebujeme mnoho RNA.Množství extrahované RNA je více než dostatečné.

Správný koncept je:Extrakce RNA by měla sledovat čistotu, integritu a konzistenci.Čistota může zajistit, že následná reverzní transkripce nebude inhibována a data nebudou ovlivněna DNA.Integrita zajišťuje rovnováhu cílových sekvencí a interních referencí.Konzistence zajišťuje stabilní zatížení vzorku.

MIQE (4) – reverzní transkripce
Mylná představa: snaha o vyšší objem vzorku.
Správný koncept: Usilujte o konzistenci (stabilitu), bez ohledu na množství naložené RNA, účinnost reverzní transkripce zůstává konzistentní, což zajišťuje, že rozdíly v cDNA mohou skutečně odrážet rozdíly v mRNA.
Tento proces vysvětlíme schematickým diagramem:

Schematický diagram účinnosti reverzní transkripce, nemusí být pravdivý
Nejprve musíme pochopit rozdíl mezi procesem reverzní transkripce a procesem PCR.PCR prochází několika procesy zahřívání a nasedání a cílový fragment roste exponenciálně;zatímco reverzní transkripce tento proces nemá, můžeme si představit, že reverzní transkripce je ve skutečnosti jedna ku jedné. Během procesu replikace se tolik kusů RNA

protože je možné získat tolik kousků cDNA informací, mělo by to být již nyní chápáno, protože velké a malé fragmenty byly reverzně transkribovány a není možné se zaměřit na jeden fragment.A protože množství RNA je relativně malé, množství získané cDNA je také relativně malé, na rozdíl od PCR, která má amplifikační efekt, takže je v podstatě nemožné ji detekovat.

Výsledky elektroforézy cDNA
Za druhé, v ideálním případě se reverzní transkripce provádí jedna ku jedné, ale tohoto efektu nemůže dosáhnout žádná reverzní transkriptáza od žádné společnosti.V zásadě se účinnost většiny reverzních transkriptáz pohybuje mezi 30-50 %.Pokud je tomu tak, raději bychom měli relativně stabilní účinnost reverzní transkripce, což je to, co chceme vidět na obrázku: 3 RNA získají 2 cDNA, 6 RNA dostane 4 cDNA, takže bez ohledu na to, kolik vzorku je naloženo, účinnost reverzní transkripce je relativně stabilní.Nechceme vidět situaci, kdy je účinnost reverzní transkripce nestabilní a vysoká koncentrace je inhibována.

Jak tedy ověřit, zda je účinnost reverzní transkripce stabilní?Metoda je velmi jednoduchá, stačí provést srovnávací test: jedním je reverzní transkripce do cDNA po dvojnásobném zředění RNA a druhým je provést zdvojené ředění po reverzní transkripci do cDNA a poté provést qPCR, abyste viděli získaný sklon Je to konzistentní.Jako špičkový student byste to měli pochopit během několika sekund.Jak je ukázáno níže:

Ředění RNA a cDNA pro testování, zda je účinnost reverzní transkripce stabilní
Reverzní transkriptáza a kit
Jak může mít perfektní fluorescenční kvantitativní PCR vynikající reverzní transkriptázu a kit.Reverzní transkriptáza se zhruba dělí na dva typy podle zdroje, AMV respM-MLVa jejich výkon je stejný jako v tabulce.

Aktivita RNázy H
RNáza H je ribonukleáza H, čínský název je ribonukleáza H, což je endoribonukleáza, která dokáže specificky hydrolyzovat RNA v hybridním řetězci DNA-RNA.RNáza H nemůže hydrolyzovat fosfodiesterové vazby v jednovláknové nebo dvouvláknové DNA nebo RNA, to znamená, že nemůže trávit jednovláknovou nebo dvouvláknovou DNA nebo RNA.Běžně se používá při syntéze druhého vlákna cDNA.

Je to zvláštní věc.Říkáme, že reverzní transkriptáza má aktivitu RNázy H, nikoli že reverzní transkriptáza obsahuje RNázu H, a nemusí být možné oddělit RNázu H od reverzní transkriptázy, možná kvůli konformaci určitých skupin v reverzní transkriptáze. Tato aktivita je způsobena reverzní transkriptázou.

Proto, bez ohledu na vyšší účinnost reverzní transkripce AMV, její aktivita RNázy H snižuje výtěžek cDNA.Výrobci činidel samozřejmě neustále optimalizují své produkty, aby co nejvíce eliminovali aktivitu RNázy H v reverzní transkriptáze, aby se zvýšil výtěžek cDNA.
Teplota žíhání

Sekundární struktura RNA při různých teplotách
Viz obrázek výše pro sekundární strukturu RNA při různých teplotách a použijte online nástroj mFold k určení sekundární struktury cílového fragmentu za specifických podmínek teploty a koncentrace soli.Při 55 °C je sekundární struktura RNA stále velmi složitá, reverzní transkriptáza nemůže fungovat a sekundární struktura nemůže být zcela vyřešena až do 65 °C, zatímco optimální teplota AMV a M-MLV je daleko nižší než tato teplota.
co dělat?Sekundární strukturou je komplementární párování samotného templátu, které vede k silné konkurenci mezi primerem a reverzní transkriptázou a templátem, což vede k řadě problémů, jako je nízká E a špatná opakovatelnost.

co dělat?Pouze co nejvíce zvyšujte teplotu žíhání .

Mnoho výrobců činidel zlepšuje svou reverzní transkriptázu pomocí genetického inženýrství.Některé zvyšují reakční teplotu, jako například Jifan a Aidelai, a některé odstraňují aktivní skupinu enzymu RNázy H, aby se zlepšila afinita mezi enzymem a templátem RNA.Vysoká afinita může kompetitivně vytlačit sekundární strukturu a číst ji hladce a také výrazně zlepšit účinnost reverzní transkripce.
Klíčový bod: Reverzní transkripce je důležitější pro dosažení konzistence účinnosti reverzní transkripce (enzymy musí být nejen účinné, ale také stabilní), spíše než množství naloženého vzorku, pokud se nebude jednat o zvláště rozsáhlou fluorescenční kvantitativní PCR, nebude to vůbec možné.Vícenásobné cDNA.
Různí výrobci také vyvinuli určité úsilí ve snaze o konzistenci.Například většina společností nyní přibalila zpětný přepis jako standardní sadu na prodej, což je dobrá volba.
Například sady Foregene RT Easy Series:

RT Easy I (Master premix pro soupravu pro syntézu prvního vlákna cDNA)

MIQE (5) – informace o cílovém genu

Výše uvedený obrázek vysvětluje
1. Zda je tento gen účinný pro opakované experimenty, lze obecně ověřit opakovanými experimenty.
2. Gene ID, víte.
3. Délka genu, celková délka cílového genu rozhodně není žádný problém.Při navrhování primerů zajistěte, aby délka amplikonu byla mezi 80-200 bp, aby byla zajištěna lepší účinnost amplifikace.
4. Informace o porovnání sekvencí Blast, cílový gen je třeba porovnat v genové bance, aby se zabránilo nespecifické amplifikaci.
5. Přítomnost pseudogenů.Pseudogen je sekvence DNA podobná normálnímu genu, ale ztrácí svou normální funkci.Často existuje v multigenové rodině eukaryot.Obvykle je reprezentován ψ.Jde o nefunkční kopii genomové DNA v genomu, která je velmi podobná sekvenci kódujícího genu., obecně nejsou přepisovány a nemají jasný fyziologický význam.
6. Poloha primerů vzhledem k exonům a intronům.V prvních letech, kdy jsme řešili problém kontaminace DNA, jsme často věnovali pozornost pozicím primerů, exonů a intronů a obecně jsme zvažovali navrhování primerů napříč introny, abychom se vyhnuli amplifikaci DNA.Podívejte se prosím na obrázek níže: černá představuje introny, různé modré představují exony, růžová představuje běžné primery a jasně červená představuje primery překlenující introny.

Schéma, nikdy pravda
Vypadá to jako dokonalý plán, ale ve skutečnosti ve většině případů trans-intronové primery nejsou tak kouzelné, jak si představovali, a také způsobí nespecifickou amplifikaci.Takže nejlepším způsobem, jak zabránit kontaminaci DNA, je úplné odstranění DNA.
7. Predikce konformace.Znovu použijte tento příklad a použijte online nástroj mFold k určení sekundární struktury cílového fragmentu při specifické teplotě a koncentraci soli.

Sekundární struktura RNA při různých teplotách
Sekundární strukturou je komplementární párování samotného templátu, které povede k silné konkurenci mezi párováním primeru a templátu a šance na navázání primeru jsou menší, což vede k řadě problémů, jako je nízká E a špatná opakovatelnost.Prostřednictvím softwarové predikce, pokud neexistuje problém se sekundární strukturou, by to bylo skvělé.Pokud ano, náš následující článek bude konkrétně diskutovat o tom, jak tento problém vyřešit.

MIQE (6) — qPCR oligonukleotidy

U fluorescenční kvantitativní PCR je první věcí, se kterou každý den bojujete, extrakce RNA a druhou věcí může být návrh primeru.
Nejprve stále kontrolujeme pravidla pro návrh primerů podle kontrolního seznamu MIQE.Je to tak jednoduché, že se šmejdi mohou smát a můžeme to zakončit jednou větou: zjistit sekvenci a polohu primérové ​​sondy a metodu modifikace.Pro metodu purifikace primerů je v současnosti syntéza primerů tak levná, qPCR je hodná purifikačních metod PAGE a vyšších a informace o nástroji syntézy nejsou důležité.Mnoho lidí dělá primery po celá desetiletí a neví, že syntezátor je ABI3900.
Pokud jde o principy návrhu primeru, nemusíte si je pamatovat nazpaměť, protože většina softwaru pro návrh primerů nebo online nástrojů se o tyto problémy dokáže postarat (doporučený online nástroj primer3.ut.ee/) a 99,999 % návrhu primeru se neprovádí ručně Podívejte se, autor někdy navrhuje stovky primerů denně, pokud budete číst jeden po druhém, bude to křížem krážem.
Po navržení primerů zkontrolujte následující body:
1. Navrhněte primery blízko 3' konce: V případě použití oligo dT primerů pro syntézu prvního vlákna cDNA, s ohledem na účinnost reverzní transkripce a integritu RNA, je třeba navržené primery navrhnout blízko 3' konce, aby se zlepšila účinnost amplifikace.Použijte obrázek k vysvětlení následovně (není to žádným způsobem pochopit):

Proč by měly být primery navrženy blízko 3′ konce, to nesmí být pravda
2. Hodnota TM: Hodnota Tm je při 55-65 °C (protože aktivita exonukleázy je nejvyšší při 60 °C) a obsah GC je 40 %-60 %.
3. BLAST: Aby se zabránilo nespecifické amplifikaci genomu, musí být Blast použit pro dodatečné ověření.

MIQE(7)—proces qPCR

1. Souprava qPCR
Dle požadavků MIQE musíme v článku jasně popsat kompletní reakční podmínky včetně konfigurace reakčního systému PCR, jaký kit se používá, kdo je výrobce, jak velký je reakční systém, zda se používá metoda barviva nebo sonda, nastavení programu PCR.Řidiči veteránů určitě zjistí, že pokud je sada vybrána, výše uvedené informace jsou v podstatě určeny.
V současnosti je výroba a výroba fluorescenčních kvantitativních PCR kitů velmi vyspělou technologií.Pokud si nevyberete extrémně špatné výrobce, pravděpodobnost problémů není vysoká, ale přesto se s vámi chceme podělit o několik bodů:
Hot-start Taq enzym:Nejdůležitější částí PCR je hot-start Taq enzym.Hot-start enzymy na trhu se obecně dělí na dva typy, jeden je chemicky modifikovaný hot-start enzym (můžete si to představit jako zalití parafínem) a druhý je hot-start enzym pro modifikaci protilátek (vazba antigen-protilátka).Chemická modifikace je časná cesta enzymů s horkým startem.Když je dosaženo určité teploty, enzym uvolní svou aktivitu.Protilátkou modifikovaný enzym horkého startu využívá biologické metody k blokování aktivity enzymu.Když je dosaženo určité teploty, protilátka bude denaturována a inaktivována jako protein a do hry se zapojí enzymová aktivita.

K čemu to však je?Je tomu tak, uvolňovací aktivita enzymů modifikovaných protilátkou je rychlejší než u enzymů chemicky modifikovaných, takže z hlediska citlivosti mají enzymy modifikované protilátkou mírnou výhodu, takže v kitech na trhu v podstatě žádné chemicky modifikované enzymy nejsou.Pokud ano, pak technologie tohoto výrobce stále uvízla v éře tisíciletí.
Koncentrace hořčíkových iontů:Koncentrace hořčíkových iontů je při PCR reakci velmi důležitá.Vhodná koncentrace hořčíkových iontů může podporovat uvolňování aktivity enzymu Taq.Pokud je koncentrace příliš nízká, aktivita enzymu se výrazně sníží;pokud je koncentrace příliš vysoká, dojde k zesílení nespecifické amplifikace katalyzované enzymem.Koncentrace hořčíkových iontů také ovlivní nasedání primerů, teplotu tání templátu a produktů PCR, čímž ovlivní výtěžek amplifikovaných fragmentů.Koncentrace hořčíkových iontů je obecně řízena na 25 mM.Samozřejmě, pro dobrý kit musí být koncentrace iontů hořčíku dobře kontrolována.Někteří obchodníci přidávají do činidla chelatační činidlo pro hořčíkové ionty, čímž lze dosáhnout efektu automatické úpravy koncentrace hořčíkových iontů.
Koncentrace fluorescenčního barviva:Fluorescenční barvivo, což je SYBR Green, kterou obvykle používáme, generuje fluorescenci hlavně vazbou na menší žlábek dvouvláknové DNA, protože vazba barviva na dvouvláknovou DNA je nespecifická, to znamená, že pokud je s ní kombinována dvouvláknová DNA, může dojít k fluorescenci, takže primer-dimery a templáty DNA v systému se s ní spojí a vytvoří se s ní.
PS: Vzhledem ke svým vlastnostem citlivým na světlo jsou produkty na trhu obvykle baleny do hnědých neprůhledných centrifugačních zkumavek (jak je znázorněno na obrázku níže).To však narazí na problém.Při odběru vzorků je obtížné zjistit, zda je kapalina nasávána.V tomto ohledu je Qingke skutečně uživatelsky nejpřívětivější (jak ukazuje obrázek níže) a průhledná tuba je zabalena v neprůhledném plechovém sáčku.Poté jej vložte do plechového sáčku, přičemž vezměte v úvahu pohodlí vyhnout se světlu a odběru vzorků.Musíte vybrat správné číslo produktu.TSE204 je super nákladově efektivní existence, kvůli které chci sázet trávu.

Velmi důležitá je také koncentrace fluorescenčního barviva.Pokud je koncentrace příliš nízká, křivka amplifikace se v pozdější fázi nezvedne a není dokonalá;pokud je koncentrace příliš vysoká, způsobí rušení šumem.Protože fluorescenční kvantitativní PCR závisí hlavně na hodnotě CT, není-li koncentrace fluorescenčního barviva správně nastavena, je dolní bod lepší než vysoký bod.Nejlepší je samozřejmě vhodná koncentrace barviva.

ROX: Barviva ROX se používají ke korekci chyb fluorescenčního signálu mezi jamkami.Někteří výrobci přístrojů vyžadují kalibraci, jiní ne.Například použití amplifikačního přístroje Real Time PCR společnosti Thermo Fisher Scientific obvykle vyžaduje kalibraci, včetně 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus atd. Popisují to obecné pokyny k soupravě.
Foregene qPCR Mix také obsahuje ROX barvivo, které je vhodné pro použití v různých modelech.

Real Time PCR Kit-Taqman

Slabá úprava vodíkovými vazbami: Léčba slabých vodíkových vazeb je poměrně technická záležitost.Nic nečetlo manuály mnoha stavebnic, ale žádná z nich toto téma nezmínila.Ve skutečnosti je to tak důležité.Kombinace bází závisí především na síle vodíkových vazeb.Silné vodíkové vazby jsou normální amplifikací a slabé vodíkové vazby vedou k nespecifické amplifikaci.Pokud slabé vodíkové vazby nelze dobře eliminovat, nelze se vyhnout nespecifické amplifikaci.V rámci autora si tohoto problému všimlo jen několik společností.Při nákupu sady se můžete podívat, zda jste v tomto ohledu zvažovali řešení pro sadu, kterou si chcete vybrat.

Reakční objem: Běžněji se používá systém 20-50ul a menší objemy pravděpodobně způsobí chyby.Obecně řečeno, návod k soupravě doporučí použití objemů PCR reakce.Nebuďte chytří a používejte menší objemy, abyste ušetřili náklady.cílem.Objem doporučený obchodníky byl skutečně testován a může se stát, že nemohou vyřešit problém s chybami způsobenými malými objemy.
2. Výrobce a číslo výrobku trubkovnice
Princip fluorescenční kvantitativní PCR zná každý.Sběr fluorescence se provádí hlavně pomocí uzávěrů zkumavek PCR.Při výběru spotřebního materiálu pro PCR věnujte pozornost dvěma bodům: dobrá propustnost světla a vhodná pro daný přístroj.Obecně lze říci, že desky a elektronky mainstreamových značek jsou v pořádku, ale musíte pečlivě vybírat z hlediska přizpůsobení, jinak nástroj nebudete moci používat.

4. Špičkové znalosti

MIQE (8) — ověření qPCR
Toto je nejvyšší priorita qPCR!Tolik hrdinů zde spadlo do písku.Samozřejmě je také možné, že máte štěstí a geny, které jste studoval, jsou jednoduché, takže jste se vznášeli ledovou jeskyní podél větru.Ověřovací informace qPCR jsou určeny k testování spolehlivosti dat.Potřebné ověřovací informace uvádíme takto:

1.Zkouška specifičnosti
Specifičnost amplifikace cílového genu se testuje kontrolou, zda je obraz elektroforézy jeden pás;ověřování sekvenování;křivka tání, aby se zjistilo, zda je mapa píku jednoduchá;ověření trávení enzymů a další metody.
Zde se zaměřujeme na tanalýza nespecifické amplifikace metodou křivek tání.Obecně řečeno, když navrhujeme primery, je požadováno, aby velikost fragmentu produktu byla v rozmezí 80-200 bp, což činí teplotu tání produktu PCR v rozmezí 80-85 °C.Pokud tedy existují různé píky, musí existovat další nespecifické amplifikační produkty;pokud se pík objeví pod 80 °C, je obecně považován za dimer primeru;pokud se pík objeví nad 85 °C, je to obecně považováno za kontaminaci DNA nebo více nespecifickou amplifikaci velkých fragmentů.
Poznámka: Někdy je při 80 °C pouze jeden pík.V tuto chvíli je třeba tento koncept dodržovat.Je pravděpodobné, že výsledky amplifikace jsou všechny primerové dimery.

Normální křivka tání (jeden pík bez nespecifické amplifikace)

Problematická křivka tání (nespecifická amplifikace falešných píků)
【Analýza případu】

Existuje hlavní pík, ale dimer primeru je vážný
Jednovrcholová křivka tání na obrázku níže může snadno oklamat vaše oči, protože si myslí, že jde o dokonalý experiment, ale výsledek je zcela mylný.V tomto okamžiku se musíme podívat na teplotu tání.Maximální teplota je pod 80 °C, což je zcela primer-dimer.

Žádný cílový fragment, všechny primerové dimery
Tady, můj bratr nemůže přestat.Na obrázku níže je fotka pořízená mobilem, kterou mi poslal zmetek.Všechny reagencie, které použil, jsou běžně používané značky v průmyslu.Změnil jednu značku T-prefix na jinou značku T-prefix.Myslím, že už jste to uhodli.Ten zmetek na mě křičel: „Činidlo použité na prvním obrázku je příliš dobré a pík je jednoduchý.Později, po použití vámi doporučeného činidla, bude vypadat jako na druhém obrázku se smíšenými píky.Udělal jsi mě nešťastným.“
Oddělte dva grafy.Na první pohled má jeden jediný kšilt a druhý dvojitý kšilt.Nesmysl, jediný vrchol je samozřejmě v pořádku.Je to pravda?
Horší než Dou E, když dám dva obrázky na obrázek níže, okamžitě pochopíte.Ve skutečnosti jsme tímto druhem obrazu snadno paralyzováni.Po pečlivé analýze jsme zjistili, že: pík na prvním obrázku je při 75 °C, což je zcela primerový dimer;vrchol druhého čísla se objeví při 75 °C a 82 °C, alespoň tam je Produkt se objeví.

Obrázky zpětné vazby od studentů
Zásadním problémem tedy není problém reagencií, ale problém návrhu primeru.Zároveň to také dokazuje, že některé velké značky nemají kvalitu železa, a také to dokazuje to, co řekl můj bratr: Není to značka činidla, která podporuje váš článek.Je to váš článek, který podpořil značku činidel.Jen si představte, že kdyby ten zmetek nevyměnil reagencie, do deníku by se poslala špatná data a to, co by se stalo, by byla tragédie.
2. Hodnota Ct kontroly slepého vzorku
Nevysvětlujte, pokud má slepá kontrola hodnotu Ct, není to znečištění?Stále však musíte pochopit, který prázdný ovládací prvek má hodnotu Ct.Pokud je to NTC, znamená to, že existuje cizí DNA, jako je kontaminace reagencií.Pokud se jedná o NRT, znamená to, že extrahovaná RNA má kontaminaci DNA.
3. Standardní křivka
Včetně sklonu a vzorce pro výpočet lze účinnost PCR vypočítat pomocí vzorce.Dokonalý experiment vyžaduje, aby se sklon standardní křivky přiblížil 3,32 a R² se přiblížil 0,9999.
4. Lineární dynamický rozsah
Dynamický rozsah reakce je lineární.Podle šablony použité pro vytvoření standardní křivky by dynamický rozsah měl zahrnovat alespoň 5 koncentračních gradientů a věnovat pozornost změně hodnot Ct při vysokých koncentračních gradientech a nízkých koncentračních gradientech.
5. Přesnost detekce
Změny ve výsledcích qPCR, tedy špatná opakovatelnost, tedy špatná přesnost, jsou způsobeny mnoha faktory, včetně teploty, koncentrace a provozu.Přesnost qPCR se obecně stává méně kontrolovatelnou, když se počet kopií snižuje.Ideálně v rámci experimentální variace by tato technická variace měla být odlišná od biologické variace a biologické replikace mohou přímo řešit statistické rozdíly ve výsledcích qPCR mezi skupinami nebo ošetřeními.Zejména u diagnostických testů musí být uvedena nejlepší přesnost mezi testy (opakovatelnost) napříč místy a operátory.
6. Účinnost detekce a LOD (v multiplexní qPCR)
LOD je nejnižší koncentrace z 95 % zjištěných pozitivních vzorků.Jinými slovy, koncentrace LOD obsažená v sadě replikátů cílových genů by neměla překročit 5 % neúspěšných reakcí.Při provádění multiplexní analýzy qPCR, zejména pro současnou detekci bodových mutací nebo polymorfismů, musí multiplexní qPCR poskytnout důkaz, že přesnost více cílových fragmentů není ohrožena ve stejné zkumavce, účinnost vícenásobné detekce a detekce jedné zkumavky by měly být stejné.Tomuto problému je třeba věnovat pozornost, zvláště když jsou současně amplifikovány cílové geny s vysokou koncentrací a cílové geny s nízkou koncentrací.
Problémy a řešeníObecně řečeno, problémy, se kterými se často setkáváme při ladění qPCR, se zaměřují na následující aspekty:
·nespecifická amplifikace
· Obtížná volba koncentrace roznětky a potíže s roznětkami-dimery
· Teplota žíhání je nepřesná
·Sekundární struktura ovlivňuje účinnost zesílení
nespecifická amplifikace
nespecifická amplifikacenastane , obecně se zvažuje, zda návrh primeru není vhodný, ale pokud na výměnu primerů nespěcháte, můžete nejprve vyzkoušet následující metody (princip je také přiložen):
·Zvyšte teplotu žíhání – snažte se, aby slabé vodíkové vazby nebylo možné udržet;
·Zkrácení doby žíhání a prodloužení – snižuje možnost vzniku slabých vodíkových vazeb;
·Snížit koncentraci primerů – snížit možnost vazby redundantních primerů a necílových oblastí;
Nízká účinnost zesílení
Opačná situace než u nespecifického zesílení – nízká účinnost zesílení a opatření k řešení nízké účinnosti zesílení jsou přesně opačná:
·Prodlužte dobu žíhání a prodloužení;
·Změňte na tříkrokovou PCR a snižte teplotu žíhání;
·Zvyšte koncentraci primeru;
Ps: Mnoho postgraduálních studentů narozených v 90. letech není ochotno studovat, jak ladit experimenty, a doufají, že sada dokáže problém zcela vyřešit (pokud chcete po promoci jít do reagenční společnosti, aby dělala výzkum a vývoj), ve skutečnosti takto uvažují i ​​výrobci činidel, doufám, že je to blázen. .Aby se problém snadno vyřešil, musí si hlupáci stále přečíst úvod společnosti činidel, aby zjistili, zda existuje faktor, který absorbuje slabé vodíkové vazby.
Obtížná volba koncentrace primeru a potíže s primer-dimery
Metoda 1: Obecně řečeno, pokyny k soupravě pro qPCR obsahují doporučené systémy a doporučené koncentrace primerů.
Metoda 2: Ladění nastavením gradientu koncentrace primeru.Níže uvedený obrázek je pro ilustraci odcizen jedné společnosti.Obrázek níže ukazuje fluorescenční kvantitativní výsledky získané se třemi gradienty koncentrace primeru (100 nM, 250 nM, 500 nM) a čtyřmi gradienty koncentrace templátu (0,1 ng, 1 ng, 10 ng, 100 ng).Hodnota Ct experimentálních výsledků je vynesena následovně:

Výběr koncentrace primeru Zřetězte každou koncentraci primeru do řady následovně:

Volba koncentrace primeru je zřejmá, lineární vztah koncentrace primeru 100 nM a 250 nM je lepší a lineární vztah koncentrace primeru 500 nM je relativně špatný.V 100 nM a 250 nM je hodnota Ct 250 nM relativně malá, takže optimální koncentrace primeru je 250 nM.Obecně lze na křivce tání vidět silné primer-dimery.Co když se navržené primery nemohou vyhnout primer-dimerům?
Metoda 3: Snižte množství primerů a zvyšte teplotu žíhání (není třeba vysvětlovat).
Empirická hodnota teploty žíhání je 60°C.Pokud si nejste jisti, jak zvolit vhodnější teplotu žíhání?Odpověď je stejná jako volba koncentrace primeru –gradientový test.Pro ilustraci problému udělejte obrázek od společnosti Bio-rad.Pro amplifikaci určitého cílového fragmentu nastavte osm teplotních gradientů, každý se třemi opakováními, a získaná amplifikační křivka je následující:

volba teploty žíhání:
·70°C, 69°C—Primery v zásadě nelze kombinovat, takže nedochází k žádné amplifikaci.
·67,3°C – Na začátku je malé zesílení a hodnota Ct je relativně velká.
·64.5°C——Hodnota Ct klesá.
· Při 60,7 °C, 58,0 °C, 56,2 °C a 55,0 °C měly hodnoty Ct v zásadě tendenci být stabilní, ale konečné hodnoty fluorescence byly odlišné.
Jak si vybrat?Princip: Prvním principem je vyšší hodnota Ct.Pro stejnou hodnotu Ct zvolte vyšší teplotu žíhání, abyste zabránili dimerizaci a nespecifické amplifikaci.I když je hodnota fluorescence vyšší při 55 °C, mohou v ní být dimery nebo nespecifická amplifikace.
Ale pokud jste tak chytří jako vy, určitě si pomyslíte: Logicky řečeno, pokud je PCR reakce velmi specifická, pokud koncentrace primeru přesahuje minimální požadavek, neměly by mít vysoké a nízké body žádný účinek, stejně jako fluorescenční barviva a dNTP.Ve skutečnosti, pokud je teplota nasedání správně optimalizována, bude účinek koncentrace primeru na hodnotu Ct přirozeně minimalizován.

Teplota nasedání je správně optimalizována a vliv koncentrace primeru na CT bude minimalizován
Sekundární struktura ovlivňuje účinnost zesílení
Vezměme si obrázek z Bio-rad pro ilustraci problému.Navrhuje také teplotní gradient pro amplifikaci genu se sekundární strukturou.

Objevuje se sekundární struktura
Je vidět, že jak se teplotní gradient snižuje, začnou se objevovat produkty a hodnota Ct se posouvá vpřed a dosahuje minimální hodnoty při 60,7 °C, a poté, jak se teplotní gradient snižuje, hodnota Ct se zvyšuje.Naopak při zvýšení teploty se sekundární struktura otevírá a účinnost zesílení se zvyšuje.Po dosažení určité teploty nemůže zvýšení teploty zlepšit účinnost zesílení.Protože primery v tuto chvíli nelze stabilně kombinovat.Proto,hledejte teplotu s nejnižší hodnotou Ct, což je nejlepší teplota pro zesílení šablony sekundární struktury!Chytří hlupáci samozřejmě musí vědět, že pokud to není nutné, je nejlepší vyměnit primery a vyhnout se oblasti sekundární struktury.
5. Aplikační úroveň
MIQE — Analýza dat

Analýza dat je prováděna především fluorescenčním kvantitativním PCR přístrojem.V předchozím článku bylo provedeno mnoho práce na analýze dat, jako je kontrola slepého pokusu, která byla vysvětlena v návrhu experimentu.Interní referenční geny, čísla opakování atd. byly objasněny., zde vysvětlujeme především aplikaci qPCR.
qPCR je široce používána a experimentální ověření a diagnostika nukleových kyselin jsou nejčastěji používanými scénáři.
absolutní kvantifikace
Log (počáteční koncentrace) má lineární vztah k počtu cyklů.Standardní křivka může být nakreslena ze standardu se známým počátečním počtem kopií, to znamená, že lze získat lineární vztah amplifikační reakce.Podle hodnoty Ct vzorku lze vypočítat koncentraci ve vzorku.Množství šablon, které se mají zahrnout.

Metoda absolutního kvantitativního výpočtu
Absolutní kvantifikace musí být založena na standardní křivce.K vytvoření standardní křivky je vyžadován standard.Obvykle je standardem plazmid získaný klonováním cílového genu.Proč je to plazmid?Protože kruhová plazmidová DNA je nejstabilnější.Standardní produkt řeďte v 5 až 6 gradientech podle dvojnásobného poměru (10násobné ředění) a při ředění dbejte na rovnoměrnost.Nechte hodnotu Ct klesnout mezi 15-30.

Standardní příprava
Současně by měl být testovaný vzorek také odpovídajícím způsobem zředěn (pamatujte na faktor ředění) a hodnota Ct by také měla ležet mezi 15-30.Standardní produkt + vzorek, který má být testován, jsou umístěny na stroji společně.Po běhu byla vytvořena standardní křivka se standardní látkou a vzorky, které měly být testovány, byly přeneseny do standardní křivky pro výpočet koncentrace.
Kvantifikace viru hepatitidy B HBV je typická absolutní kvantifikace, která dokáže vypočítat počet kopií viru v 1 ml krve.
Výpočet počtu kopií
Koncentrace vzorku k testování (ng/ul) = OD260 × 50 ug/ml × faktor ředění
Molekulová hmotnost vzorku = počet bází × 324
Počet kopií vzorku, který má být testován (kopie/ul) = koncentrace vzorku, který má být testován / molekulová hmotnost vzorku × 6 × 1014

Způsob výpočtu počtu kopií

Výše uvedený je způsob výpočtu pro stanovení množství.Jedná se o matematický problém, který lze vyřešit po absolvování střední školy, a matematické problémy obecně řeší počítače.Pokud nerozumíte, můžete přijít komunikovat.
relativní kvantifikace
Relativní kvantifikace se používá především ve vědeckém výzkumu.Kolik virů je v 1ml krve a jedná se o DNA virus, to je poměrně deterministický jev: lze určit množství krve a DNA virus je relativně stabilní.Je však pro nás obtížné porovnávat počet transkripčních kopií určitého genu v listu, protože je obtížné určit velikost, hmotnost a citlivost listu, je obtížné určit množství extrahované RNA a také je obtížné určit účinnost reverzní transkripce, to znamená, že jakýkoli krok může způsobit, že experimentální data budou obsahovat chyby a nebude možné je použít.
Proto musí relativní kvantifikace zavést prvek:vnitřní referenční gen.
Jinými slovy, relativní kvantifikace je vlastně srovnání mezi cílovým genem a interním referenčním genem.Ve srovnání ve stejné tkáni a stejné buňce je vliv velikosti vzorku, množství extrakce RNA, účinnosti reverzní transkripce a účinnosti PCR relativně malý.Vzhledem k malé velikosti vzorku byly jak vnitřní referenční geny, tak cílové geny relativně sníženy.To je důvod, proč jsme již dříve kladli důraz na uniformitu a stabilitu.
Vnitřní referenční geny jsou obecněúklidové geny(house-keeping geny), které se týkají třídy genů, které jsou stabilně exprimovány ve všech buňkách a jejich produkty jsou nezbytné pro udržení základních životních aktivit buněk.
Nepleťte si tento pojem.Housekeeping geny jsou termíny biologické funkce, zatímco interní referenční geny jsou experimentální technické termíny.Housekeeping geny musí projít validací, než mohou být vybrány jako interní referenční geny.
Například jsme vybrali několik provozních genů na obrázku níže, abychom otestovali jejich úrovně exprese v různých tkáňových buňkách, a zjistili jsme, že úrovně exprese β-2-mikroglobulinu byly zcela odlišné od úrovní ostatních tří genů, takže je nebylo možné použít jako interní referenční geny.

Po pochopení korekční funkce interního referenčního genu jsou odvozeny dva algoritmy díky zavedení interního referenčního genu.
· metoda dvojité standardní křivky
·2 – △△Ct metoda (metoda porovnání hodnot CT)
Máte-li zájem studovat druhy a funkce genů, vzdejte se výzkumu algoritmů a používejte přímo vzorce nebo přímo stroje;pokud jste rovný chlap v matematice a inženýrství, neváhejte.
metoda dvojité standardní křivky
Kvantifikujte cílový gen a provozní gen kontrolního vzorku a vzorku, který má být testován, pomocí standardní křivky a poté vypočítejte relativní hodnotu podle vzorce pro výpočet, což je relativní hladina exprese.
Výhody: jednoduchá analýza, relativně jednoduchá experimentální optimalizace
Nevýhoda: Pro každý gen musí každé kolo experimentů vytvořit standardní křivku
Aplikace: Jedna ze dvou nejčastěji používaných a uznávaných relativních kvantitativních metod při studiu regulace genové exprese
Vzorec je následující:

Příklady jsou následující:

Vypočítejte relativní množství na základě kvantitativního výsledku
2 – metoda △△Ct (metoda porovnání hodnot CT)

Výhody: Není třeba vytvářet standardní křivku
Nevýhody: Předpokládá se, že účinnost zesílení se blíží 100 %;standardní odchylka je < 5 % a předpokládá se, že standardní křivka a účinnost mezi každou amplifikací jsou konzistentní;optimalizace experimentálních podmínek je složitější.
Aplikace: Jedna ze dvou nejčastěji používaných a uznávaných relativních kvantitativních metod při studiu regulace genové exprese

Samozřejmě, že účinnost amplifikace je obvykle nemožné dosáhnout dokonale 1. Korekční metoda: Pokud víme, že cílový gen a referenční gen mají stejnou účinnost amplifikace, ale účinnost amplifikace není rovna 1, pak 2－△△Ct lze korigovat jako: (1+E )－ je△△Ct, lze korigovat amplifikaci podle vzorce 0 1,95－△△Ct
Obsah o fluorescenční kvantitativní PCR zatím skončil.