Žádné zesilovací signály

1.Taq DNA polymeráza v soupravě ztrácí svou aktivitu v důsledku nesprávného skladování nebo expirace soupravy.
Doporučení: Potvrďte podmínky skladování soupravy;znovu přidejte vhodné množství Taq DNA polymerázy do systému PCR nebo si pro související experimenty zakupte novou sadu Real Time PCR Kit.

2.V templátu DNA je mnoho inhibitorů Taq DNA polymerázy.
Návrh: Znovu vyčistěte šablonu nebo snižte množství použité šablony.

3. Koncentrace Mg2+ není vhodná.
Doporučení: Koncentrace Mg2+ námi dodaného 2× Real PCR Mix je 3,5 mM.U některých speciálních primerů a templátů však může být koncentrace Mg2+ vyšší.Proto můžete přímo přidat MgCl2 pro optimalizaci koncentrace Mg2+.Pro optimalizaci se doporučuje pokaždé zvýšit Mg2+ 0,5 mM.

4. Podmínky amplifikace PCR nejsou vhodné a sekvence nebo koncentrace primeru jsou nevhodné.
Návrh: potvrďte správnost sekvence primeru a primer nebyl degradován;pokud amplifikační signál není dobrý, zkuste snížit teplotu nasedání a vhodně upravte koncentraci primeru.

5. Množství šablony je příliš malé nebo příliš velké.
Doporučení: Proveďte ředění gradientem linearizace templátu a vyberte koncentraci templátu s nejlepším efektem PCR pro experiment Real Time PCR.

NTC má příliš vysokou hodnotu fluorescence

1.Kontaminace reagencií způsobená během provozu.
Doporučení: Vyměňte za nová činidla pro experimenty PCR v reálném čase.

2. Ke kontaminaci došlo během přípravy reakčního systému PCR.
Doporučení: Během provozu proveďte nezbytná ochranná opatření, jako jsou: nošení latexových rukavic, použití špičky pipety s filtrem atd.

3. Primery jsou degradovány a degradace primerů způsobí nespecifickou amplifikaci.
Návrh: Použijte elektroforézu SDS-PAGE k detekci, zda jsou primery degradovány, a nahraďte je novými primery pro experimenty Real Time PCR.

Primer dimer nebo nespecifická amplifikace

1. Koncentrace Mg2+ není vhodná.
Doporučení: Koncentrace Mg2+ námi dodávaného 2× Real PCR EasyTM Mix je 3,5 mM.U některých speciálních primerů a templátů však může být koncentrace Mg2+ vyšší.Proto můžete přímo přidat MgCl2 pro optimalizaci koncentrace Mg2+.Pro optimalizaci se doporučuje pokaždé zvýšit Mg2+ 0,5 mM.

2. Teplota žíhání PCR je příliš nízká.
Návrh: Zvyšte teplotu žíhání PCR pokaždé o 1 °C nebo 2 °C.

3. Produkt PCR je příliš dlouhý.
Doporučení: Délka produktu Real Time PCR by měla být mezi 100-150 bp, ne více než 500 bp.

4. Primery jsou degradovány a degradace primerů povede ke vzniku specifické amplifikace.
Návrh: Použijte elektroforézu SDS-PAGE k detekci, zda jsou primery degradovány, a nahraďte je novými primery pro experimenty Real Time PCR.

5. Systém PCR je nesprávný nebo je systém příliš malý.
Návrh: Systém reakce PCR je příliš malý, což způsobí snížení přesnosti detekce.Pro opětovné spuštění experimentu Real Time PCR je nejlepší použít reakční systém doporučený nástrojem pro kvantitativní PCR.

Špatná opakovatelnost kvantitativních hodnot

1. Přístroj nefunguje správně.
Návrh: Mezi každým otvorem PCR přístroje mohou být chyby, což má za následek špatnou reprodukovatelnost během řízení teploty nebo detekce.Zkontrolujte prosím podle pokynů příslušného přístroje.

2. Čistota vzorku není dobrá.
Doporučení: Nečisté vzorky povedou ke špatné reprodukovatelnosti experimentu, což zahrnuje čistotu templátu a primerů.Nejlepší je znovu purifikovat templát a primery se nejlépe čistí pomocí SDS-PAGE.

3. Doba přípravy a skladování systému PCR je příliš dlouhá.
Doporučení: Použijte systém Real Time PCR pro PCR experiment ihned po přípravě a nenechávejte jej stranou příliš dlouho.

4. Podmínky amplifikace PCR nejsou vhodné a sekvence nebo koncentrace primeru jsou nevhodné.
Návrh: potvrďte správnost sekvence primeru a primer nebyl degradován;pokud amplifikační signál není dobrý, zkuste snížit teplotu nasedání a vhodně upravte koncentraci primeru.

5. Systém PCR je nesprávný nebo je systém příliš malý.
Návrh: Systém reakce PCR je příliš malý, což způsobí snížení přesnosti detekce.Pro opětovné spuštění experimentu Real Time PCR je nejlepší použít reakční systém doporučený nástrojem pro kvantitativní PCR.