Escherichia Coli O157: H7 Nucleic Acid Detection Kit (PCR metoda fluorescenční sondy/lyofilizace)
Popis sady:
Kat.č.FP103
Používá se pro rychlou detekci a screening E. coli O157:H7 ve vzorcích potravin, krmiv, vody a vzorků životního prostředí.
Popisy
Používá se prorychlá detekce a screening E. coli O157:H7 ve vzorcích potravin, krmiv, vody a vzorků životního prostředí.
[Princip testování]
Podle principu fluorescenční PCR technologie jsou specifické primery a Taqman sondy navrženy pro specifický gen Escherichia coli O157: H7 a detekovány fluorescenčním PCR přístrojem tak, aby byla realizována detekce Escherichia coli O157: H7 Kvalitativní detekce DNA.
Obsah sady
Poznámka: Kanálová sonda ROX není součástí dodávky.
| Csoučásti | Specifikace | Qjednotnost |
| Vyrovnávací paměť A | Trubka | 1 |
| Vyrovnávací paměť B | Trubka | 1 |
| Pozitivní kontrola | Trubka | 1 |
| Negativní kontrola | Trubka | 1 |
Očekávané použití
Používá se pro rychlá detekce a screening E. coli O157:H7 ve vzorcích potravin, krmiv, vody a vzorků životního prostředí.
Podmínky skladování a datum expirace
Skladujte při -20 °C v temnu a vyhněte se opakovanému zmrazování a rozmrazování.
Doba platnosti je 12měsíce a datum výroby je uvedeno na vnějším obalu.
Nástroje a spotřební materiál
Fluorescenční kvantitativní PCR přístroj, pipetovací pistole a odpovídající špičky, vortex shaker, minicentrifuga.
Používání
1. Zpracování vzorku
1.1 Typ vzorku: Tato souprava je vhodná pro vzorky potravin, krmiv, vody a další vzorky podezřelé z kontaminace Escherichia coli O157:H7.U hluboce zpracovaných masných výrobků, nápojů a dalších látek obsahujících pigmenty je třeba je opláchnout, aby nedošlo k ovlivnění sběru fluorescenčního signálu.
1.2 Zpracování vzorků: Viz „GB 4789.10-2016 Národní standardní potravinářské mikrobiologické vyšetření Escherichia coli O157: H7 Test bezpečnosti potravin“ pro přípravu vzorku, obohacení kultury a izolaci Escherichia coli O157: H7.
- Nextrakce kyseliny ukleové
Vezměte 20 ml obohacovacího roztoku do 1,5 ml centrifugační zkumavky, přidejte 200 μl mikrobiálního lyzátu (vyžaduje se přídavná sada), vortexujte po dobu 30 sekund, krátce odstřeďte a odložte stranou.
Poznámky: Extrakce nukleové kyseliny z lyzátu by měla být dokončena do 10 minut a nelze ji skladovat po dlouhou dobu.
3. Amplifikace nukleové kyseliny
3.1 Před použitím zapněte fluorescenční kvantitativní PCR přístroj.
Pufr A a Pufr B ze soupravy, důkladně je roztavte a krátce odstřeďte.Přidejte 18 μl pufru A a 2 μl pufru B do každé reakční zkumavky PCR.Poté přidejte 5 ml každé negativní kontroly, extrahované nukleové kyseliny a pozitivní kontroly do PCR reakčních zkumavek, zkumavky uzavřete a krátce odstřeďte.
3.3 Přeneste reakční zkumavku PCR do fluorescenčního zařízení pro PCR a k provedení amplifikačních experimentů použijte následující postupy: vyberte 25 ml pro reakční systém, shromážděte fluorescenční signály při 60 °C pro každý cyklus a pro detekční kanál vyberte FAM.
| Krok | Program | Počet cyklů |
| 1 | 37 ℃ 5 min | 1 |
| 2 | 9 5 ℃ 3 min | 1 |
| 3 | 95°C 15s | 40 |
| 60℃ 30s (sbírat fluorescenci) |
Příručky pro analýzu problémů
The following is an analysis of the problems that might be encountered in the extraction of viral RNA. We wish it would be helpful to your experiment. In addition, for other experimental or technical problems other than operating instructions and problem analysis, we have dedicated technical support to help you. Contact us if you need at : 028-83361257or E-mail：Tech@foregene.com。
Nelze extrahovat žádnou RNA nebo je výtěžek nukleové kyseliny nízký
Obvykle existuje mnoho faktorů, které ovlivňují efektivitu regenerace, jako například: obsah RNA vzorku, způsob operace, eluční objem atd.
Analýza běžných příčin:
1. Ledová lázeň nebo nízkoteplotní (4 °C) centrifugace za provozu.
Doporučení: Provoz při pokojové teplotě (15-25 °C), nikdy ledová lázeň a nízkoteplotní odstředivka.
2. Nesprávné skladování vzorků nebo příliš dlouhé skladování vzorků.
Doporučení: Vzorky skladujte při -80 °C nebo zmrazte v tekutém dusíku a vyhněte se opakovanému použití zmrazování a rozmrazování;zkuste použít čerstvě odebrané vzorky pro extrakci RNA.
3. Nedostatečná lýza vzorku
Doporučení: Ujistěte se, že vzorek a pracovní roztok (lineární akrylamid) byly důkladně promíchány a inkubovány po dobu 10 minut při pokojové teplotě (15-25 °C)
4. Eluent byl přidán nesprávně
Doporučení: Ujistěte se, že ddH2O bez RNázy je přidána do středu membrány čistící kolony
5. Nesprávný objem bezvodého ethanolu v pufru viRW2
Doporučení: Postupujte podle pokynů, přidejte správný objem bezvodého etanolu do pufru viRW2 a před použitím sady je dobře promíchejte.
6. Nesprávné použití vzorku.
Návrh: 200 µl vzorku na 500 µl pufru viRL.Nadměrný objem vzorku povede ke snížení rychlosti extrakce RNA.
7. Nesprávný eluční objem nebo neúplná eluce.
Návrh: Objem eluentu v purifikační koloně je 30-50 μl;pokud není eluční efekt uspokojivý, doporučuje se přidat předehřátý ddH bez RNázy2O a prodlužte dobu umístění při pokojové teplotě, např. 5-10 min
8. Purifikační kolona obsahuje ethanolový zbytek po propláchnutí v pufru viRW2.
Návrh: Pokud po propláchnutí v pufru viRW2 a centrifugaci v prázdné zkumavce po dobu 2 minut stále zůstává ethanol, lze purifikační kolonu po centrifugaci v prázdné zkumavce nechat 5 minut při pokojové teplotě, aby se zcela odstranil zbývající etanol.
Degradace purifikovaných molekul RNA
Kvalita purifikované RNA souvisí s faktory, jako je skladování vzorku, kontaminace RNázou a provoz.
Analýza běžných příčin:
1. Odebrané vzorky nebyly včas uloženy.
Doporučení: Pokud vzorek po odběru nepoužijete včas, ihned jej uložte při teplotě -80 ℃ nebo kapalném dusíku.Pro extrakci molekul RNA se snažte použít čerstvě odebrané vzorky, kdykoli je to možné.
2. Odebrané vzorky opakovaně zmrazovaly a rozmrazovaly.
Doporučení: Během odběru a skladování vzorků se vyvarujte opakovaného zmrazování a rozmrazování (ne více než jednou), jinak se sníží výtěžek nukleové kyseliny.
3.Na operačním sále byla zavedena RNáza nebo nebyly nošeny jednorázové rukavice, masky atd.
Návrh: Experiment s extrakcí molekul RNA se nejlépe provádí v samostatné operační místnosti RNA a před experimentem se experimentální stůl vyčistí.Během experimentu používejte jednorázové rukavice a masky, abyste zabránili degradaci RNA způsobené zavedením RNázy.
4. Činidlo je během použití kontaminováno RNázou.
Návrh: Vyměňte za novou sadu pro izolaci virové RNA pro související experimenty.
5. Kontaminace centrifugačních zkumavek, špiček pipet atd. RNázou. Doporučení: Ujistěte se, že všechny centrifugační zkumavky, špičky a pipety neobsahují RNázu.
Purifikované molekuly RNA ovlivnily následné experimenty
Molekuly RNA purifikované purifikační kolonou ovlivní následné experimenty, pokud je příliš mnoho solných iontů nebo proteinů, jako jsou: reverzní transkripce, Northern Blot atd.
1.V eluovaných molekulách RNA jsou zbývající ionty solí.
Doporučení: Ujistěte se, že do pufru viRW2 byl přidán správný objem bezvodého etanolu a promyjte purifikační kolonu dvakrát podle správné rychlosti odstřeďování v návodu k obsluze；Pokud stále zbývají ionty solí, můžete do purifikační kolony přidat pufr viRW2 a nechat jej při pokojové teplotě po dobu 5 minut.Poté proveďte centrifugaci, abyste co nejvíce odstranili kontaminaci solnými ionty
2. V eluovaných molekulách RNA je zbývající ethanol
Návrh: jakmile potvrdíte, že purifikační kolony byly propláchnuty pufrem viRW2, proveďte centrifugaci v prázdné zkumavce podle odstředivé rychlosti v návodu k obsluze.Pokud stále zbývá ethanol, lze jej po centrifugaci v prázdné zkumavce ponechat 5 minut při pokojové teplotě, aby se zbývající etanol co nejvíce odstranil.
Návody k použití:
Návod k použití soupravy pro izolaci virové RNA
