Je dobře známo, že v centrálním dogmatu je RNA mediátorem transkripce mezi DNA a expresí proteinů.Ve srovnání s detekcí DNA může detekce RNA objektivněji odrážet genovou expresi v organismech.Experimenty zahrnující RNA zahrnují: qRT-PCR, RNA-Seq a detekci fúzního genu atd. Na základě vlastností samotné RNA (cukerný kruh RNA má o jednu volnou hydroxylovou skupinu více než cukerný kruh DNA), ve spojení s velkým počtem RNáz v prostředí, je RNA nestabilnější a snáze se degraduje než DNA.Garbage in, garbage out, pokud kvalita RNA není dobrá, pak musí být výsledky experimentu neuspokojivé, konkrétně se projevující jako nepřesná data nebo špatná opakovatelnost.Zpracování RNA by proto měla být věnována větší pozornost a vazba kontroly kvality je také důležitější pro zajištění přesnosti a správnosti následných experimentálních dat.

Pro kontrolu kvality RNA se obecně používají následující běžně používané metody:

• Spektrofotometrie
• elektroforéza na agarózovém gelu
• Bioanalyzátor Agilent
• fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase
• Metoda fluorescenčního barviva Qubit

01 Spektrofotometrie

RNA má konjugované dvojné vazby a má absorpční pík při vlnové délce 260 nm.Podle Lambert-Beerova zákona můžeme vypočítat koncentraci RNA z absorpčního píku při 260nm.Kromě toho můžeme také vypočítat čistotu RNA podle poměru absorpčních píku 260nm, 280nm a 230nm.280nm a 230nm jsou absorpční vrcholy proteinů a malých molekul.Poměr A260/A280 a A260/A230 kvalifikované čistoty RNA by měl být větší než 2. Pokud je menší než 2, znamená to, že ve vzorku RNA je kontaminace proteinem nebo malou molekulou a je třeba jej znovu purifikovat.Zdroje kontaminace ovlivní následné experimenty, jako je inhibice účinnosti amplifikace reakcí PCR, což má za následek nepřesné kvantitativní výsledky.Čistota RNA má velký vliv na následné výsledky, takže spektrofotometrie je obecně nepostradatelným článkem kontroly kvality v prvním kroku experimentů s nukleovými kyselinami.

Obrázek 1. Typické RNA/DNA absorpční spektrum

02 Elektroforéza na agarózovém gelu

Jedním z důležitých ukazatelů pro posuzování kvality RNA je kromě čistoty také integrita RNA.Degradace RNA povede k velkému počtu krátkých fragmentů ve vzorku, takže počet fragmentů RNA, které lze účinně detekovat a pokrýt referenční sekvencí, se sníží.Integritu RNA lze zkontrolovat elektroforézou celkové RNA na 1% agarózovém gelu.Touto metodou můžete konfigurovat gel sami nebo použít prefabrikovaný systém E-Gel™ pro testování integrity.Více než 80 % celkové RNA je ribozomální RNA, z nichž většinu tvoří 28S a 18S rRNA (v savčích systémech).RNA dobré kvality bude vykazovat dva zřejmé světlé pruhy, což jsou světlé pruhy 28S a 18S, v tomto pořadí, při 5 Kb a 2 Kb, a poměr bude mít tendenci blížit se 2:1.Pokud je v difuzním stavu, znamená to, že vzorek RNA mohl být degradován a k dalšímu testování kvality RNA se doporučuje použít metodu popsanou později.

Obrázek 2. Porovnání degradované (dráha 2) a intaktní RNA (dráha 3) na elektroforéze na agarózovém gelu

03 Bioanalyzátor Agilent

Kromě výše popsané metody elektroforézy na agarózovém gelu, která nám může pomoci snadno a rychle identifikovat integritu RNA, můžeme k určení integrity RNA použít také bioanalyzátor Agilent.K hodnocení koncentrace a integrity RNA využívá kombinaci mikrofluidiky, kapilární elektroforézy a fluorescence.Pomocí vestavěného algoritmu pro analýzu profilu vzorku RNA může bioanalyzátor Agilent vypočítat referenční hodnotu integrity RNA, číslo integrity RNA (dále jen RIN) [1].Čím vyšší je hodnota RIN, tím vyšší je integrita RNA (1 je extrémně degradovaná, 10 je nejúplnější).Některé experimenty zahrnující RNA navrhují použití RIN jako parametru pro hodnocení kvality.Vezmeme-li jako příklad vysoce výkonné sekvenační experimenty (dále jen NGS), pokyny Oncomine™ Human Immune Repertoire, které se používají k detekci antigenních receptorů B buněk a T buněk v řadě panelů Thermo Fisher's Oncomine, naznačují, že lze měřit vzorky s hodnotami RIN vyššími než 4, efektivnější čtení a klony (obrázek 3).Pro různé panely jsou různé doporučené rozsahy a často může vyšší RIN přinést efektivnější data.

Obrázek 3, v experimentech Oncomine™ Human Immune Repertoire mohou vzorky s RIN větším než 4 detekovat efektivnější čtení a klony T buněk.【2】

Hodnota RIN má však také určitá omezení.Přestože RIN má vysokou korelaci s kvalitou experimentálních dat NGS, není vhodný pro vzorky FFPE.Vzorky FFPE byly chemicky upravovány po dlouhou dobu a extrahovaná RNA má obecně relativně nízkou hodnotu RIN.To však neznamená, že efektivní data experimentu musí být neuspokojivá.Pro přesné posouzení kvality vzorků FFPE musíme použít jiná měření než RIN.Kromě RIN umí Agilent bioanalyzer také vypočítat hodnotu DV200 jako hodnotící parametr kvality RNA.DV200 je parametr, který vypočítává podíl fragmentů větších než 200 bp ve vzorku RNA.DV200 je lepším indikátorem kvality vzorku FFPE než RIN.Pro RNA extrahovanou pomocí FFPE má velmi vysokou korelaci s počtem genů, které lze účinně detekovat, a diverzitou genů [3].Přestože DV200 může nahradit nedostatky v detekci kvality FFPE, bioanalyzátor Agilent stále nedokáže komplexně analyzovat problémy s kvalitou ve vzorcích RNA, včetně toho, zda jsou ve vzorcích inhibitory.Samotné inhibitory mohou ovlivnit účinnost amplifikace následných experimentů a snížit množství užitečných dat.Abychom zjistili, zda je ve vzorku inhibitor, můžeme použít fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase popsanou dále.

04 fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase

Metoda fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase dokáže nejen detekovat inhibitory ve vzorku, ale také přesně odrážet kvalitu RNA ve vzorku FFPE.Ve srovnání s biologickými analyzátory Agilent jsou fluorescenční kvantitativní nástroje v reálném čase populárnější ve velkých biologických laboratořích kvůli jejich širšímu použití.Abychom mohli otestovat kvalitu vzorků RNA, potřebujeme pouze zakoupit nebo připravit primerové sondy pro interní referenční geny, jako je GUSB (kat. č. Hs00939627).Použitím této sady primerů, sond a standardů (celková RNA o známé koncentraci) k provádění absolutních kvantitativních experimentů lze vypočítat efektivní koncentraci fragmentu RNA jako hodnotící standard kvality RNA (zkráceně funkční kvantitativní RNA (FRQ)).V testu NGS jsme zjistili, že FRQ vzorků RNA má velmi vysokou korelaci s efektivním objemem dat.U všech vzorků větších než 0,2 ng/ul FRQ může alespoň 70 % odečtů účinně pokrýt referenční sekvenci (obrázek 4).

Obrázek 4, hodnota FRQ detekovaná fluorescenční kvantitativní metodou má velmi vysokou korelaci (R2>0,9) s efektivními daty získanými v experimentu NGS.Červená čára je hodnota FRQ rovna 0,2 ng/ul (log10 = -0,7).【4】

Kromě toho, že je použitelná na vzorky FFPE, může metoda kvantitativní PCR v reálném čase také účinně monitorovat inhibitory ve vzorcích.Můžeme přidat vzorek, který má být detekován, do reakčního systému s interní pozitivní kontrolou (IPC) a jeho testem a poté provést fluorescenční kvantifikaci pro získání hodnoty Ct.Pokud hodnota Ct zaostává za hodnotou Ct v reakci bez vzorku, znamená to, že inhibitor je ve vzorku přítomen a inhibuje účinnost amplifikace v reakci.

05 Metoda fluorescenčního barviva Qubit

Fluorometr Qubit je nejběžněji používaný malý přístroj pro detekci koncentrace a čistoty nukleových kyselin, který se snadno ovládá a existuje téměř v každé laboratoři molekulární biologie.Přesně vypočítává koncentraci nukleové kyseliny pomocí detekce a fluorescenčního barviva vázajícího nukleovou kyselinu (detekční činidlo Qubit).Qubit má vysokou citlivost a specificitu a dokáže přesně kvantifikovat RNA až na koncentraci pg/µL.Kromě dobře známé schopnosti přesně kvantifikovat koncentraci nukleové kyseliny dokáže nejnovější nový model Thermo Fisher, Qubit 4.0, také detekovat integritu RNA.Systém detekce RNA Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) detekuje integritu RNA simultánní detekcí dvou specifických fluorescenčních barviv.Tato dvě fluorescenční barviva se mohou vázat na velké fragmenty a malé fragmenty RNA.Tato dvě fluorescenční barviva indikují podíl velkých fragmentů RNA ve vzorku a z toho lze vypočítat hodnotu IQ (Integrity and Quality) představující kvalitu RNA.Hodnota IQ je použitelná pro FFPE i non-FFPE vzorky a má velký vliv na následnou kvalitu sekvenování.Vezmeme-li jako příklad experimenty NGS, v testovacích experimentech RNA-Seq prováděných na platformě Ion torrent™ měla většina vzorků s hodnotami IQ vyššími než 4 alespoň 50% efektivní čtení (obrázek 5).Ve srovnání s výše uvedenými detekčními metodami je Qubit IQ Assay nejen pohodlnější na ovládání a zabere méně času (do pěti minut), ale má také velkou korelaci mezi naměřenou hodnotou parametru IQ a kvalitou dat následných experimentů.

Obrázek 5, existuje velká korelace mezi hodnotou Qubit RNA IQ a mapovanými hodnotami RNA-Seq.【5】

Prostřednictvím výše uvedeného úvodu věřím, že každý dostatečně rozumí různým metodám kontroly kvality RNA.V praxi si můžete vybratodpovídající metodu podle typu vzorku a stávajících přístrojů.Pouze dobrou kontrolou kvality RNA se můžeme vyhnout selhání následných experimentů způsobené špatnou kvalitou vzorku, čímž ušetříme drahocenný čas, energii a náklady.

Referenční produkty:

Animal Total RNA Isolation Kit

Souprava pro izolaci buněčné celkové RNA

Reference

【1】Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. a kol.RIN: číslo integrity RNA pro přiřazení hodnot integrity měřením RNA.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】Uživatelská příručka Oncomine Human Immune Repertoire (č. publikace MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Vylepšené metriky kvality pro hodnocení RNA odvozené z archivních vzorků tkáně zalité ve formalínu, Toxicological Sciences, 7. vydání, 27. srpen 300 ,https://doi.org/10.1093/toxsci/