Byli jsme zkušeným výrobcem.Získání většiny v klíčových certifikacích svého trhu pro velkou slevu China High Sensitivity One-Step Probe Rt-QpcrKit V2, Kvalita je život továrny, Zaměření na poptávku zákazníků je zdrojem přežití a rozvoje společnosti, Dodržujeme poctivost a pracovní postoj v dobré víře, těšíme se na váš příchod!
Byli jsme zkušeným výrobcem.Získání většiny v klíčových certifikacích na svém trhuChina Taq DNA polymeráza, Qpcr, Naše společnost slibuje: rozumné ceny, krátký výrobní čas a uspokojivý poprodejní servis, vítáme vás, abyste navštívili naši továrnu kdykoli budete chtít.Přejeme si, abychom spolu měli příjemný a dlouhodobý obchod!!!

Popisy

Tato souprava využívá unikátní systém lyzačního pufru, který dokáže rychle uvolnit RNA ze vzorků kultivovaných buněk pro reakce RT-qPCR, čímž eliminuje časově náročný a pracný proces purifikace RNA.Templát RNA lze získat za pouhých 7 minut.Reagencie 5×Direct RT Mix a 2×Direct qPCR Mix-SYBR, které jsou součástí sady, mohou rychle a efektivně získat kvantitativní výsledky PCR v reálném čase.

5×Direct RT Mix a 2×Direct qPCR Mix-SYBR mají silnou toleranci inhibitorů a lyzát vzorků lze použít přímo jako templát pro RT-qPCR.Tato sada obsahuje unikátní RNA vysoce afinitní reverzní transkriptázu Foregene a Hot D-Taq DNA polymerázu, dNTPs, MgCl₂, reakční pufr, PCR optimalizátor a stabilizátor.

Specifikace

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Součásti stavebnice

Vlastnosti a výhody

■ Jednoduché a efektivní: s technologií Cell Direct RT lze vzorky RNA získat za pouhých 7 minut.

■ Potřeba vzorku je malá, lze testovat pouze 10 buněk.

■ Vysoká propustnost: dokáže rychle detekovat RNA v buňkách kultivovaných na 384, 96, 24, 12, 6-jamkových destičkách.

■ DNA Eraser může rychle odstranit uvolněné genomy a výrazně snížit dopad na následné výsledky experimentů.

■ Optimalizovaný systém RT a qPCR činí dvoukrokovou reverzní transkripci RT-PCR účinnější a PCR specifičtější a odolnější vůči inhibitorům reakce RT-qPCR.

Aplikace sady

Oblast použití: kultivované buňky.

- RNA uvolněná lýzou vzorku: použitelná pouze pro RT-qPCR templát této soupravy.

- Soupravu lze použít pro následující účely: analýza genové exprese, ověření účinku umlčování genů zprostředkovaného siRNA, screening léků atd.

Diagram

Skladování a trvanlivost

Část I této sady by měla být skladována při 4 °C;Část II by měla být skladována při -20 °C.

Foregene Protease Plus II by měl být skladován při 4 ℃, nezmrazovat při -20 ℃.

Reagent 2×Direct qPCR Mix-SYBR by měl být skladován při -20 °C v temnu;při častém používání může být také skladován při 4 °C pro krátkodobé skladování (spotřebujte do 10 dnů). Jsme zkušeným výrobcem.Získání většiny klíčových certifikací svého trhu pro velkou slevu v Číně s vysokou citlivostí jednokroková sonda Rt-Qpcr Kit V2, kvalita je život továrny, zaměření na poptávku zákazníků je zdrojem přežití a rozvoje společnosti, dodržujeme poctivost a pracovní přístup v dobré víře a těšíme se na váš příchod!
Velké slevyChina Taq DNA polymeráza, Qpcr, Naše společnost slibuje: rozumné ceny, krátkou dobu výroby a uspokojivý poprodejní servis, vítáme vás, abyste navštívili naši továrnu kdykoli budete chtít.Přejeme si, abychom spolu měli příjemný a dlouhodobý obchod!!!

QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

Kat.č.DRT-01021/01022

Pro buněčnou přímou RT-qPCR s použitím ≤ 1000 000 buněk

Představení produktu

Tento produkt používá jedinečný systém lyzačního pufru k rychlému uvolnění RNA z kultivovaných buněčných vzorků pro reakce RT-qPCR, čímž se eliminuje časově náročný a pracný proces čištění RNA a pouze 7 minut k získání požadovaného templátu RNA, s 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman poskytovanými soupravou může rychle a efektivně získat kvantitativní výsledky PCR v reálném čase.

5× Direct RT Mix a 2× Direct qPCR Mix-Taqman mají silnou toleranci inhibitoru a mohou provádět účinnou reverzní a specifickou amplifikaci pomocí lyzátu vzorku, který má být měřen, jako templátu.Činidlo obsahuje Foregene reverzní transkriptázu, Hot D-Taq DNA polymerázu, dNTPs, MgCl₂, reakční pufr, PCR Optimizer a stabilizátor, který lze použít s lyzačním pufrem k rychlé a snadné detekci vzorků a má vlastnosti vysoké citlivosti, specificity a stability.

Vlastnosti produktu

Jednoduchá a efektivní technologie Cell Direct RT, která trvá pouhých 7 minut, než získáte vzorky RNA.

Požadavky na vzorky jsou malé a pro experimenty lze použít minimálně 10 kultivovaných buněk.

Vysoká propustnost pro rychlé získání RNA kultivovaných buněk, jako jsou 384, 96, 24, 12 a 6-jamkové destičky.

DNA Eraser je schopen rychle odstranit uvolněné genomy, což výrazně snižuje dopad na následné výsledky experimentů.

Optimalizované systémy RT a qPCR umožňují dvoukrokovou RT-PCR s účinnější reverzní transkripcí, specificitou a silnější tolerancí inhibitoru reakce RT-qPCR.

Aplikace sady

Oblast použití: Kultivované buňky.

RNA interpretovaná lýzou vzorku: používá se pouze jako dvoukrokový templát RT-qPCR.

Soupravy lze použít pro následující účely: analýza exprese regulace genů, testování alel, screening léků atd.

Omezení sady

Amplifikované fragmenty ≤ 300 bp.

Kity se používají k čerstvé kultivaci buněk.

Kontrola kvality produktu

Podle systému Total Quality Management společnosti FOREGENE je každá šarže souprav řady Cell Direct RT-qPCR několikrát přísně testována, aby byla zajištěna spolehlivost a stabilita kvality každé šarže souprav.

Obsah sady

*:Cell Lysis, 5×Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman lze zakoupit samostatně, podrobnosti jsou uvedeny v příloze 1 (STRANA 13).

Podmínky skladování

1. Přepravní podmínky

Celý proces přepravy boxu na led při nízké teplotě, aby bylo zajištěno, že sada je ve stavu <4 °C.

2. Podmínky skladování

Část I skladujte při 4 °C a část II při -20 °C.

Foregene Protease Plus II by měl být skladován při 4 °C, ne zmražen při -20 °C.

Reagent 2× Direct qPCR Mix-Taqman se skladuje při -20 °C nebo při 4 °C pro krátkodobé použití, pokud se používá často (do 10 dnů).

Informace o součástech sady

Buffer CL: Poskytuje prostředí potřebné pro reakce buněčné lýzy.

Buffer ST: Ukončí účinnou látku v lyzátu, aby se zabránilo účinkům na následnou RT.

DNA Eraser: Odstraňovač DNA, účinek odstranění genomu na následné experimenty.

5× Direct RT Mix: Obsahuje Foregenovou reverzní transkriptázu s vysokou afinitou k RNA, inhibitor RNázy, dNTP, stabilizátory, zesilovače, optimalizátory a primery reverzní transkripce pro optimální zarovnání (Random Primer, Oligo(dT)₁₈Základní nátěr).

Foregene Protease Plus II: V kontextu lyzačního pufru jsou buňky lyžovány, aby se uvolnily nukleové kyseliny.

2× Direct qPCR Mix-Taqman: Toto činidlo obsahuje Hot D-Taq DNA polymerázu, dNTPs, MgCl₂reakční pufr, PCR optimalizátor a stabilizátor.

20× ROX Reference Dye: Obecně se používá na amplifikačních přístrojích Real Time PCR od ABI, Stratagene a dalších společností, používá se k úpravě rozdílu mezi zkumavkami PCR a zkumavkami způsobenými chybami v dávkování PCR.20× koncentrace referenčního barviva ROX požadovaná pro různé nástroje je různá a uživatel ji může přidat podle doporučené koncentrace nástroje.

ddH bez RNázy₂O: Sterilizovaná ultra čistá voda bez RNázy pro dvoustupňové reakce RT-qPCR.

Opatření:(Před použitím sady si pozorně přečtěte bezpečnostní opatření)

Věnujte pozornost provozní metodě experimentu, aby nedošlo ke křížové kontaminaci mezi vzorky.

Dbejte na čistotu experimentálního prostředí a náčiní, aby nedošlo ke kontaminaci RNázou a degradaci RNA.

Odebírejte čerstvé nebo dobře uchované vzorky buněk a nikdy nepoužívejte opakované vzorky buněk zmražené a rozmražené.

5× Direct qPCR Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman by se měl vyhnout opakovanému zmrazení-rozmrazení, jinak to ovlivní reverzní transkripci a účinnost PCR.

Prepapřídělypředúkon

Před použitím této sady si pozorně přečtěte pokyny.Obsluha Cell Direct RT-qPCR Kit je jednoduchá, pohodlná a rychlá a návod poskytuje kompletní informace o celé soupravě a o tom, jak ji správně používat.Před použitím si prosím připravte potřebné experimentální materiály a vybavení.

Experimentální materiály a zařízení

◆ Kultivace buněk.

◆ 1,5 ml nebo 2 ml, centrifugační zkumavka RNase-/DNase-Free, RNase-/DNase-Free tip, 0,2 ml sterilní qPCR zkumavka.

◆ qPCR stroj, pipeta, stolní centrifuga (≥13 400×g) (v závislosti na experimentálních potřebách) atd.

Bezpečnost

◆ Tento produkt je určen pouze pro účely vědeckého výzkumu, nepoužívejte jej pro farmaceutické, klinické, potravinářské a kosmetické účely.

◆ Při používání chemikálií používejte vhodný laboratorní oděv, rukavice, ochranné brýle atd.

Úkonprůvodci

Systémy buněčné lýzy, RT systémy a doplňkové balíčky reakčního roztoku qPCR lze zakoupit samostatně, podrobnosti najdete v Příloze 1 (STRANA 13).

Návod k obsluze

A: Uvolnění vzorku RNA

1. Buňky byly předem ošetřeny: Promyjte destičku s buněčnou kulturou studeným PBS, poté buňky lyžujte (10-10⁶), 10⁶ než množství buněk, se doporučuje Foregen the Cell an RNA Isolation Kit Total (DE-03111) nebo Animal Total RNA Isolation Kit (DE-03011) pro extrakci a purifikaci RNA.

1.1.Adherentní buňky (24jamková destička jako příklad)

1.1.1.Určete počet buněk v každé jamce, určete, že počet buněk je 1 × 10⁵a pomocí pipety odeberte kultivační médium z kultivační misky.

1.1.2.Do každé jamky přidejte 200 μl předem vychlazeného 1 × PBS.Nepipetujte opakovaně a odstraňte PBS z jamek.Nakloňte desku a odstraňte co nejvíce PBS.Pokračujte krokem 2.

1.1.3.Byla přidána jiná miska pro buněčnou kulturu nebo tabulka referenčních čísel 1-1 v misce pro buněčnou kulturu předchlazený 1 x PBS pro promytí buněk.

Tabulka 1-1: Dávkování PBS pro různé počty buněk

Poznámka：Pro zajištění pevné přilnavosti buněk,při mytí je zabráněno velkému počtu ztrát buněk.

1.2.Suspenzní buňky nebo adherentní buňky kultivované na neporézních plotnách

1.2.1.Adherentní buňky kultivované na jiných než vícejamkových destičkách (suspenzní buňky začínají od dalšího kroku 1.2.2), shromážděte a oddělte buňky podle normální metody sběru buněk a umístěte je do kultivační destičky nebo centrifugační zkumavky;pokud se používá trypsinizace, vyžaduje centrifugaci pro sběr buněk a pro odstranění zbytkového trypsinu, přidá se PBS resuspendované buňky do jednotlivých buněk, aby se buňky dispergovaly.

1.2.2.Po počtu spočítaných buněk byly buňky rozděleny na alikvoty 1 x 10⁵ jednu do centrifugačních zkumavek, odeberte buňky centrifugací při 1000 × g po dobu 10 min.

1.2.3.Přidejte 200 μl PBS do centrifugační zkumavky, nepipetujte opakovaně a přímo aspirujte PBS.pokračujte krokem 2. (Pokud je obtížné vysrážet a buňky byly znovu resuspendovány, lze provést 1000×g centrifugaci 10 minut po odstranění supernatantu, buněčná peleta pokračujte krokem 2)

2.Lýza buněk: Odstraňte Buffer CL, jeho teplotu ekvilibrovanou na pokojovou teplotu, DNA Eraser a Foregene Protease Plus II, podle následující tabulky 1-2 připravený lyzační systém: (Lytický roztok je připraven k použití).

Tabulka 1-2: štěpení příprava systému (pozn.: při přípravě na ledu)

3.( 24-jamková destička jako příklad) Do každé jamky napipetujte 200 μl master mixu pro lýzu buněk, opakovaně foukejte 5-10krát, inkubujte při pokojové teplotě (20-25 ℃) po dobu 5 minut.

Poznámka：Aby se zabránilo tvorbě bublin, při pipetování nastavte pipetu na 200 μl nebo méně.Buňky se mohou po lýze jevit zakalené, což je normální.

4. (24-jamková destička jako příklad) se přidá do kapaliny 20 μl pufru ST (různé lyzační systémy přidaný pufr ST v množství uvedeném v tabulce 1-3), opakované pipetování 5-10krát, při pokojové teplotě (20-25 ℃) byly inkubovány po dobu 2 minut.

Poznámka：Špička pipety byla umístěna pod povrchem, čímž bylo zajištěno, že byl přidán lyzát,aby se zabránilo tvorbě bublin, při pipetování nastavte pipetu na 200 μl nebo méně.

Tabulka 1-3：Přidejte vyrovnávací paměť ST

5. Lyzát se použije pro následné experimenty RT-qPCR.Pokud nelze následné experimenty provést včas, uchovávejte jej na ledu ne déle než 2 hodiny a skladujte při -20 °C nebo -80 °C (ne déle než tři měsíce).

B: Příprava systému RT

1.Vyjměte 5 × Direct RT Mix a umístěte jej na ledovou lázeň, nechte přirozeně rozpustit a jemně promíchejte pro pozdější použití;vyjměte ddH2O bez RNázy a roztavte ji a umístěte ji na ledovou lázeň pro pozdější použití.Připravte reakční systém na ledu podle tabulky 2-1 níže.

Tabulka 2-1: Příprava RT reakčního systému

2.Po dokončení formulace systému jemně promíchejte a krátce odstřeďte v následující tabulce 2-2 reakční podmínky RT reakce.

Tabulka 2-2: Nastavení podmínek reakce RT

3. Po dokončení reakce byl reakční produkt umístěn přímo na led pro qPCR, vložte prosím dlouhodobou konzervaci -20 ℃ nebo -80 ℃.

Poznámka: Vzhledem k použití nečištěného templátu se mohou v produktu reverzní transkripce objevit bílé sraženiny.To je normální jev.Supernatant ihned centrifugujte pro další experimenty.

Výsledný reakční roztok RT se přidá do dalšího reakčního systému Step Real Time PCR, doporučuje se přidat množství v rozmezí 10-30 % reakčního systému.

C: Příprava reakčního systému qPCR

1.Odpovídající množství B připraveného v kroku cDNA templátu podle následující tabulky 3-1 pro přípravu reakčního systému.

Poznámka: Množství templátu cDNA tvoří 10-30 % systému qPCR.Například do 20μl systému qPCR přidejte 2-6 μl lyzačního pufru, ale ne více než 6 μl.

2. Optimalizace dobrých podmínek qPCR (teplota žíhání，atd.) pro reakci qPCR (reakční podmínky uvedené v tabulce 3-2).

Poznámka: Zkuste použít optimalizované podmínky pro reakce qPCR, abyste získali lepší výsledky.

Tabulka 3-1: Příprava reakčního systému PCR

1*: Koncentraci primeru lze upravit v rozsahu 50-900 nM, když je reakce primeru špatná.

Poznámka: Systém qPCR lze upravit podle experimentálních potřeb a modelu fluorescenčního cykléru.Pro qPCR za 50μl systému, upravte dávkování činidla proporcionálně podle 20μl systém.

2*: Vyberte vhodnou konečnou koncentraci referenčního barviva ROX podle fluorescenčního kvantitativního termocykleru.Nejvhodnější koncentrace referenčního barviva ROX pro běžné fluorescenční kvantitativní cyklery jsou uvedeny v tabulce níže:

Tabulka 3-2: Jsou poskytnuty reakční podmínky qPCR

Poznámka: K dosažení nejlepšího účinku qPCR lze k optimalizaci reakčních podmínek pro různé templáty a různé primery použít gradientovou PCR.Podmínky PCR reakce se liší v závislosti na fluorescenčním analyzátoru, templátu, primeru atd. V konkrétní operaci je potřeba navrhnout optimální reakční podmínky podle konkrétních podmínek fluorescenčního kvantitativního termocykleru, typu templátu, velikosti požadovaného fragmentu, sekvence bází amplifikovaného fragmentu a obsahu GC a délky primerů, včetně teploty nasedání, reakční doby atd.

Principy návrhu primerů PCR v reálném čase

Forward Primer a Reverse Primer

Pro Real Time PCR je velmi důležitý návrh primeru.Primery souvisejí se specificitou a účinností PCR amplifikace a mohou být navrženy s ohledem na následující principy:

◆ Délka primeru: 18-30 bp.

◆ Obsah GC: 40-60%.

◆ Hodnota Tm: Software pro návrh primeru, jako je Primer 5, může poskytnout hodnotu Tm primeru.Hodnoty Tm upstream a downstream primerů by měly být co nejblíže.Lze také použít vzorec pro výpočet Tm: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Při provádění PCR se jako teplota nasedání obecně volí teplota pod hodnotou Tm primeru 5 °C (odpovídající zvýšení teploty nasedání může zvýšit specifitu PCR reakce).

◆ Primery a produkty PCR:

◆ Navrhovaný primer Délka amplifikačního produktu PCR je výhodně 100-150 bp.

◆ Navrhované primery v sekundární strukturální oblasti šablony by se měly co nejvíce vyhnout.

◆ Vyhněte se tvorbě 2 nebo více komplementárních bází mezi 3′ konci upstream a downstream primerů.

◆ Základní 3′ svorkovnice nemůže být přítomna se 3 dalšími po sobě jdoucími G nebo C.

◆ Primery samotné nemohou mít komplementární struktury, jinak se vytvoří vlásenková struktura ovlivňující PCR amplifikaci.

◆ ATCG by mělo být distribuováno co nejrovnoměrněji v sekvenci primeru a 3′ terminální báze by měla být vyloučena, protože T.

slepé střevo1：Cell DirectRT-qPCR Součást stavebnicet balíček doplňků

1. Roztok pro lýzu buněk