Sterilizace špiček pipet a EP zkumavek atd.

1. Připravte 0,1% (jedna tisícina) DEPC (vysoce toxická látka) s deionizovanou vodou, opatrně ji použijte v digestoři a skladujte ji při 4 °C mimo světlo;

DEPC voda je čistá voda ošetřená DEPC a sterilizovaná vysokou teplotou a vysokým tlakem.Testováno na nepřítomnost RNázy, DNázy a proteinázy.

2. Vložte špičku pipety a EP zkumavku do 0,1% DEPC a ujistěte se, že jsou špička pipety a EP zkumavka naplněny 0,1% DEP.

3. Chraňte před světlem, nechte stát přes noc (12-24h)

4. Krabičku obsahující hrot a EP zkumavku není nutné namáčet v DEPC.Po hrubém odstranění DEPC vody ze špičky nebo EP zkumavky ji zabalte a zabalte.

5. 121 stupňů Celsia, 30min

6. 180 stupňů Celsia, sušit několik hodin (alespoň 3 hodiny)

Poznámka: a.Při manipulaci s DEPC používejte latexové rukavice a masky!b, nebo bez DEPC sterilizace, 130 ℃, 90min autokláv (mnoho laboratoří vysokoteplotní sterilizace dvakrát)

Úvahy o extrakci RNA

Dva hlavní jevy selhání izolace tkáňové RNA

degradace RNA a zbytky nečistot v tkáních,pokud jde o degradaci, podívejme se nejprve na to, proč RNA extrahovaná z kultivovaných buněk není snadno degradována.Všechny existující RNA extrakční činidla obsahují složky, které rychle inhibují RNázu.Přidejte lyzát ke kultivovaným buňkám a jednoduše promíchejte, všechny buňky lze důkladně promíchat s lyzátem a buňky jsou zcela lyžovány.Poté, co jsou buňky lyžovány, aktivní složky v lyzátu okamžitě inhibují intracelulární RNázu, takže RNA zůstává nedotčena.To znamená, že protože kultivované buňky jsou snadno a plně v kontaktu s lyzátem, jejich RNA není snadno degradována;na druhé straně je RNA ve tkáni snadno degradována, protože buňky ve tkáni nejsou snadné rychle kontaktovat lyzát.kvůli dostatečnému kontaktu.Tak,za předpokladu, že existuje způsob, jak proměnit tkáň v jedinou buňku a zároveň inhibovat aktivitu RNA, problém degradace by mohl být zcela vyřešen.

Mletí v kapalném dusíku je nejúčinnější takovou metodou.Metoda mletí kapalným dusíkem je však velmi problematická, zvláště když je počet vzorků velký.To dalo vzniknout další nejlepší věci: homogenizátoru.ThehomogenizátorMetoda nezvažuje otázku, jak je aktivita RNázy inhibována před kontaktem buněk s lyzátem, ale spíše se modlí, aby rychlost narušení tkáně byla rychlejší než rychlost, kterou intracelulární RNáza degraduje RN.

Účinek elektrického homogenizátoru je lepší,a účinek skleněného homogenizátoru je slabý, ale obecně metoda homogenizátoru nemůže zabránit jevu degradace.Pokud je tedy extrakce znehodnocena, měl by být pro mletí tekutým dusíkem použit původní elektrický homogenizátor;původní skleněný homogenizátor by měl být vyměněn za elektrický homogenizátor nebo přímo rozemlet tekutým dusíkem.Problém je téměř 100% proveditelný.vyřešit.

Problém zbytků nečistot ovlivňující následné experimenty má více různých příčin než degradace a řešení jsou odpovídajícím způsobem odlišná.Na závěr,pokud je v tkáni degradace nebo zbytkové nečistoty, musí být optimalizována extrakční metoda/činidlo pro konkrétní experimentální materiál.Nemusíte používat své vzácné vzorky k optimalizaci: můžete si koupit nějaká malá zvířata, jako jsou ryby/kuře, z trhu, vzít si odpovídající část materiálu pro extrakci RNA a druhou část pro extrakci bílkovin – rozemlít extraktem z úst, žaludku a střev.

Cílová RNA extrahované RNA se používá pro různé následné experimenty a její požadavky na kvalitu jsou různé

Konstrukce knihovny cDNA vyžaduje integritu RNA bez zbytků inhibitorů enzymové reakce;Northern vyžaduje vyšší integritu RNA a nižší požadavky na zbytky inhibitorů enzymové reakce;RT-PCR nevyžaduje příliš vysokou integritu RNA,ale inhibuje enzymové reakce.Požadavky na zbytky jsou přísné.Vstup určuje výstup;pokaždé, když je cílem získat RNA nejvyšší čistoty, bude to stát lidi a peníze.

Sběr/uchovávání vzorků

Faktory ovlivňující degradaci Poté, co vzorek opustí živé tělo/nebo původní růstové prostředí, začnou endogenní enzymy ve vzorku degradovat RNA,a rychlost degradace souvisí s obsahem endogenních enzymů a teplotou.Tradičně existují pouze dva způsoby, jak zcela inhibovat endogenní enzymovou aktivitu: okamžitě přidat lyzát a důkladně a rychle homogenizovat;nakrájíme na malé kousky a ihned zmrazíme v tekutém dusíku.Oba přístupy vyžadují rychlý provoz.Druhý je vhodný pro všechny vzorky, zatímco první je vhodný pouze pro tkáně s nízkým obsahem buněk a endogenních enzymů a snadněji se homogenizují.Konkrétně rostlinná tkáň, játra, brzlík, slinivka, slezina, mozek, tuk, svalová tkáň atd. je nejlépe zmrazit tekutým dusíkem, než budete pokračovat.

Fragmentace a homogenizace vzorků

Faktory ovlivňující degradaci a výtěžnost Fragmentace vzorku jepro důkladnou homogenizaci, což je pro úplné a úplné uvolnění RNA.Buňky mohou být přímo homogenizovány bez rozbití.Tkáně lze homogenizovat až po rozbití.Kvasinky a bakterie musí být rozbity odpovídajícími enzymy, než mohou být homogenizovány.Tkáně s nižším obsahem endogenních enzymů a snadnější homogenizací lze rozdrtit a homogenizovat najednou v lyzátu homogenizátorem;rostlinná tkáň, játra, brzlík, slinivka, slezina, mozek, tuk, svalová tkáň a další vzorky, mají buď vysoký obsah endogenních enzymů, nebo se nedají snadno homogenizovat,takže rozrušení tkáně a homogenizace musí být prováděny odděleně.Nejspolehlivější a nejproduktivnější metodou fragmentace je mletí kapalným dusíkem a nejspolehlivější metodou homogenizace je použití elektrického homogenizátoru.Zvláštní poznámka k mletí kapalným dusíkem: vzorek nesmí být rozmražen během celého procesu mletí, protože endogenní enzymy pravděpodobněji fungují při zmrazení.

Výběr lyzátu

Ovlivnění pohodlnosti provozu a faktory zbytkových endogenních nečistot Běžně používané lyzační roztoky mohou téměř inhibovat aktivitu RNázy.Proto je klíčovým bodem výběru lyzačního roztoku zvážit kombinaci s purifikační metodou.Existuje jedna výjimka:u vzorků s vysokým obsahem endogenních enzymů se doporučuje použít lyzát obsahující fenol pro zvýšení schopnosti inaktivovat endogenní enzymy.

Volba způsobu čištění

Faktory, které ovlivňují zbytkové endogenní nečistoty, rychlost extrakce U čistých vzorků, jako jsou buňky, lze dosáhnout uspokojivých výsledků téměř jakoukoli dostupnou metodou čištění.Ale pro mnoho dalších vzorků, zejména těch s vysokým obsahem nečistot, jako jsou rostliny, játra, bakterie atd., je výběr vhodné metody čištění zásadní.Metoda kolonového odstředivého čištění má vysokou rychlost extrakce a dokáže účinně odstranit nečistoty, které ovlivňují následnou enzymatickou reakci RNA, ale je drahá (Foregene může nabídnout cenově výhodné sady, více podrobností kliknětetady);použití ekonomických a klasických metod čištění, jako je srážení LiCl, lze také získat uspokojivé výsledky, ale doba provozu je dlouhá..

„Tři disciplíny a osm pozornosti“ pro extrakci RNA

Disciplína 1:Ukončete kontaminaci exogenními enzymy.

Poznámka 1:Přísně používejte masky a rukavice.

Poznámka 2:Odstředivkové zkumavky, špičky, pipetovací tyčinky, elektroforézní nádrže a experimentální stoly zapojené do experimentu by měly být důkladně zlikvidovány.

Poznámka 3:Reagencie/roztoky zahrnuté v experimentu, zejména voda, musí být bez RNázy.

Disciplína 2:Blokovat aktivitu endogenních enzymů

Poznámka 4:Zvolte vhodnou metodu homogenizace.

Poznámka 5:Vyberte vhodný lyzát.

Poznámka 6:Kontrolujte počáteční množství vzorku.

Disciplína 3:Ujasněte si účel těžby

Poznámka 7:Když se jakýkoli lyzátový systém blíží maximálnímu výchozímu množství vzorku, úspěšnost extrakce prudce klesá.

Poznámka 8:Jediným ekonomickým kritériem pro úspěšnou extrakci RNA je úspěch v následných experimentech, nikoli výtěžek.

Top 10 zdrojů kontaminace RNázou

1. Prsty jsou prvním zdrojem exogenních enzymů, proto je nutné rukavice nosit a často vyměňovat.Kromě toho se musí nosit také roušky, protože dýchání je také důležitým zdrojem enzymů.Další výhodou nošení masky v rukavicích je ochrana experimentátora.

2. Špičky pipet, centrifugační zkumavky, pipety – RNázu nelze inaktivovat samotnou sterilizací, proto by špičky pipet a centrifugační zkumavky měly být ošetřeny DEPC, i když jsou označeny jako ošetřené DEPC.Nejlepší je použít speciální pipetu, před použitím ji otřete vatou na 75% alkoholu, zejména tyčinku;navíc určitě nepoužívejte odstraňovač hlavy.

3. Voda/pufr nesmí obsahovat kontaminaci RNázou.

4. Testovací stůl by měl být otřen vatovými tampony se 75% alkoholem.

5. Endogenní RNáza Všechny tkáně obsahují endogenní enzymy, takže rychlé zmrazení tkání kapalným dusíkem je nejlepší způsob, jak snížit degradaci.Metoda skladování/mletí kapalného dusíku je skutečně nepohodlná, ale je to jediná cesta pro tkáně s vysokými hladinami endogenních enzymů.

6. Vzorky RNA Produkty extrakce RNA mohou obsahovat stopy kontaminace RNázou.

7. Extrakce plazmidu Extrakce plazmidu často využívá Rnázu k degradaci RNA a zbytková Rnáza by měla být štěpena proteinázou K a extrahována PCI.

8. Skladování RNA I když je skladována při nízké teplotě, stopová množství RNázy způsobí degradaci RNA.Nejlepším řešením pro dlouhodobé uchování RNA je suspenze sůl/alkohol, protože alkohol při nízkých teplotách inhibuje veškerou enzymatickou aktivitu.

9. Pokud kationty (Ca, Mg) obsahují tyto ionty, zahřívání na 80C po dobu 5 minut způsobí štěpení RNA, takže pokud je třeba RNA zahřát, musí konzervační roztok obsahovat chelatační činidlo (1 mM citrát sodný, pH 6,4).

10. Enzymy použité v následujících experimentech mohou být kontaminovány RNázou.

10 tipů pro extrakci RNA

1: Rychle zabraňte aktivitě RNázy.Vzorky jsou po odběru rychle zmraženy a RNáza je inaktivována rychlou operací během lýzy.

2: Zvolte vhodnou extrakční metodu pro tkáň s vysokým obsahem ribozymu a pro tukovou tkáň je nejlepší použít metodu obsahující fenol.

3: Kvalita predikce vyžaduje Northern, konstrukce knihovny cDNA vyžaduje vysokou integritu a RT-PCR a RPA (Ribonuclease protection assay) nevyžadují vysokou integritu.RT-PCR vyžaduje vysokou čistotu (zbytky inhibitorů enzymů).

4: Důkladná homogenizace je klíčem ke zlepšení výtěžku a snížení degradace.

5: Zkontrolujte integritu detekce elektroforézy RNA, 28S:18S = 2:1 je úplný znak, 1:1 je také přijatelný pro většinu experimentů.

6: Odstranění DNA pro RT-PCR, analýza pomocí čipu K odstranění DNA je nejlepší použít Dnázu I.

7: Snížit kontaminaci exogenními enzymy – enzymy nelze importovat zvenčí.

8: Při zahušťování nukleové kyseliny s nízkou koncentrací by mělo být přidáno ko-precipitační činidlo.Ale aby se zabránilo ko-precipitantu obsahujícímu enzymy a kontaminaci DNA.

9: Důkladně rozpusťte RNA, v případě potřeby zahřejte na 65C po dobu 5 minut.

vhodný způsob skladování

Může být krátkodobě skladován při –20C a dlouhodobě při –80C.Prvním krokem ke zlepšení výtěžků RNA je uvědomit si, že obsah RNA v různých vzorcích se velmi liší.Vysoká četnost (2-4 ug/mg), jako jsou játra, slinivka, srdce, střední četnost (0,05-2 ug/mg), jako je mozek, embryo, ledviny, plíce, brzlík, vaječník, nízká četnost (<0,05 ug/mg) mg), jako je močový měchýř, kosti, tuk.

1: Lyžujte buňky za účelem uvolnění RN – pokud se RNA neuvolní, výtěžek se sníží.Elektrická homogenizace funguje lépe než jiné homogenizační metody, ale může být nutné ji kombinovat s jinými metodami, jako je rmutování tekutým dusíkem, enzymatické štěpení (lysozym/lytikasa)

2: Optimalizace metody extrakce.Největším problémem metod na bázi fenolu je neúplná stratifikace a částečná ztráta RNA (supernatant nelze zcela odstranit).Neúplná stratifikace je způsobena vysokým obsahem nukleových kyselin a proteinů, což lze vyřešit zvýšením množství použitého lyzátu nebo snížením množství vzorku.Do tukové tkáně byl přidán krok extrakce chloroformem.Ztráta RNA může být snížena zpětným čerpáním nebo odstraněním organické vrstvy s následnou centrifugací.Největším problémem metod založených na kolonové centrifugaci je přebytek vzorku.

Klasické tipy na extrakci

1. Purifikace fenolu: Přidejte stejný objem 1:1 fenol/chloroform a intenzivně míchejte 1-2 minuty.Centrifugujte při vysoké rychlosti po dobu 2 minut.Opatrně odstraňte supernatant (80-90 %).Nikdy se nedostaňte do střední vrstvy.Stejný objem reakčního roztoku lze přidat do fenolu/chloroformu a odstranit supernatant.Dva supernatanty mohou být smíchány dohromady pro vysrážení nukleové kyseliny pro zlepšení výtěžku.Při míchání nebuďte příliš jemní a nesnažte se odstranit veškerý supernatant.

2. Promývání 70-80% ethanolem: Během promývání musí být nukleová kyselina suspendována, aby se zajistilo vymytí zbytkové soli.Současně ihned po slití etanolu odstřeďujte při vysoké rychlosti několik sekund a poté odstraňte zbylý etanol pipetou.Po odstátí při pokojové teplotě po dobu 5-10 minut rozpusťte.

11. Extrakce speciálních organizací

1. Fibrózní tkáň: Klíčem k extrakci RNA z vazivové tkáně, jako je srdeční/kosterní sval, je úplné rozrušení tkáně.Tyto tkáně mají nízkou hustotu buněk, takže množství RNA na jednotku hmotnosti tkáně je nízké a je nejlepší použít co nejvíce výchozího množství.Ujistěte se, že tkáň důkladně brousíte za mrazu.

2. Tkáně s vysokým obsahem bílkovin/tuků: obsah mozkových/rostlinných tuků je vysoký.Po extrakci PCI supernatant obsahuje bílé vločky.Supernatant musí být znovu extrahován chloroformem.

3. Tkáně s vysokým obsahem nukleové kyseliny/ribozymu: slezina/brzlík má vysoký obsah nukleové kyseliny a ribozymu.Mletí tkáně za mrazových podmínek s následnou rychlou homogenizací může účinně inaktivovat ribozymy.Pokud je však lyzát příliš viskózní (kvůli vysokému obsahu nukleových kyselin), nebude PCI extrakce schopna efektivně stratifikovat;přidání dalšího lyzátu může tento problém vyřešit.Více extrakce PCI může odstranit více zbytkové DNA.Pokud se ihned po přidání alkoholu vytvoří bílá sraženina, znamená to kontaminaci DNA.Opětovná extrakce kyselým PCI po rozpuštění může odstranit kontaminaci DNA.

4. Rostlinná tkáň: Rostlinná tkáň je složitější než živočišná.Obecně jsou rostliny rozemlety za podmínek kapalného dusíku, takže degradace RNA endogenními enzymy je neobvyklá.Pokud se problém s degradací nevyřeší, je téměř jistě způsoben nečistotami obsaženými ve vzorku.Nečistoty obsažené v mnoha rostlinách vedou k reziduím a důvodem reziduí je často to, že tyto nečistoty mají určité podobnosti s RNA: ty se vysráží a já se vysrážím a ty se adsorbuješ a já adsorbuji.Tyto vlastnosti určují, že se jedná o velmi silné inhibitory enzymů.

V současné době mohou být komerční činidla pro extrakci RNA přizpůsobena téměř všem živočišným tkáním s malými úpravami, ale existuje jen málo komerčních činidel pro extrakci RNA, které mohou být vhodné pro většinu rostlinných tkání.Naštěstí může Foregene poskytnout speciálnísoupravy pro extrakci rostlinné RNA, my mámePlant Total RNA Isolation kit, Plant Total RNA Isolation kit Plus.Ten je speciálně navržen pro rostliny s vysokým obsahem polysacharidů a polyfenolů.Pro extrakci RNA je zpětná vazba od laboratorních uživatelů obzvláště dobrá.

12. Vliv zmražení a rozmrazení vzorku Zmrazený vzorek může být větší a před použitím pro extrakci RNA je třeba jej rozřezat.Vzorky mají tendenci se během řezání roztavit (možná částečně).Zmrazené vzorky může být nutné před extrakcí RNA zvážit a během tohoto procesu určitě dojde k rozmrazení.Někdy dochází k rozmrazování vzorku také během procesu mletí v kapalném dusíku;nebo se zmrazený vzorek přidá přímo do lyzátu bez mletí v kapalném dusíku a k rozmrazení dojde před úplnou homogenizací.Experimenty ukázaly, že zmrazená tkáň je náchylnější k degradaci RNA během rozmrazování než tkáň čerstvá.Pravděpodobný důvod: Proces zmrazování a rozmrazování narušuje struktury v buňce, což usnadňuje endogenním enzymům přímý kontakt s RNA.

13. Posouzení kvality RNA Obvykle se k posouzení integrity RNA používá elektroforéza a k posouzení čistoty RNA se používá A260/A280.Teoreticky má intaktní RNA poměr 28S:18S = 2,7:1 a většina dat zdůrazňuje poměr 28S:18S = 2:1.Faktem je, že téměř žádná z RNA extrahovaných z jiných vzorků než z buněk není v poměru 2:1 (toto bylo získáno pomocí Agilent Bioanalyzer).

Výsledky elektroforézy RNA jsou ovlivněny mnoha faktory, včetně sekundární struktury, podmínek elektroforézy, zatížení vzorku, stupně saturace EB atd. K detekci RNA použijte nativní elektroforézu a jako kontrolu použijte DNA Marker.Pokud jsou 28S na 2 kb a 18S na 0,9 kb čisté a 28S: 18S > 1, integrita může splňovat požadavky většiny následujících experimentů.

A260/A280 je indikátor, který způsobil mnoho zmatků.Nejprve je potřeba si ujasnit původní význam tohoto indikátoru pro nukleové kyseliny: čistá RNA, její A260/280 = asi 2,0.Čistá RNA je „příčinou“ a A260/A280 = 2 je „účinek“.Nyní každý používá A260/A280 jako „příčinu“ a myslí si, že „pokud A260/A280 = 2, pak je RNA čistá“, což přirozeně vede ke zmatku.

Pokud máte zájem, můžete do vzorku RNA přidat trochu činidla, které se často používá při extrakci, jako je fenol, guanidinisothiokyanát, PEG atd., a poté změřit poměr A260/A280.Skutečností je, že mnoho činidel používaných pro extrakci RNA, stejně jako mnoho nečistot ve vzorku, absorbuje přibližně A260 a A280, což ovlivňuje A260/A280.

Nejvíce poučným přístupem v současnosti je skenování vzorků RNA v rozsahu 200-300 nm.Křivka čisté RNA má následující charakteristiky: křivka je hladká, A230 a A260 jsou dva inflexní body, A300 je blízko 0, A260/A280 = kolem 2,0 a A260/A230 = kolem 2,0.Nejsou-li k dispozici skenovací data, musí být také stanoven poměr A260/A230, protože tento poměr je citlivější na přenos všech nečistot, které ovlivňují enzymatickou reakci.Vezměte v úvahu lineární dosah zařízení (0,1–0,5 pro A260).

Existují dva další užitečné jevy: poměr bude asi o 0,3 nižší, když se A260/A280 měří ve vodě;zatímco poměr měřený v 10 mM EDTA je asi o 0,2 vyšší než poměr měřený v 1 mM EDTA.

Související produkty:

Výrobce a dodavatel sady China Plant Total RNA Isolation Kit |Foregene (foreivd.com)

RNA izolační série Dodavatelé a továrna |Výrobci čínských izolačních sérií RNA (foreivd.com)

Řada izolace RNA – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)