Experiment RT-qPCR zahrnuje extrakci RNA a hodnocení kvality, reverzní transkripci a qPCR ve třech krocích, každý krok má spoustu opatření, která podrobně představíme níže.

Ⅰ.Hodnocení kvality RNA

V experimentu RT-qPCR je po dokončení extrakce RNA potřeba vyhodnotit kvalitu RNA a následný experiment lze provést až po jeho kvalifikaci.Mezi metody hodnocení patří spektrofotometr, gelová elektroforéza Agilent, analýza Agilent 2100, mezi nimiž je nejčastěji používaný spektrofotometr a metoda detekce elektroforézou na agarózovém gelu.Je třeba poznamenat, že tyto dvě metody je třeba použít společně k dokončení detekce a analýzy koncentrace, čistoty a integrity RNA, aby byla zajištěna kvalita RNA.

Související sada pro izolaci RNA: 

Souprava pro izolaci buněčné celkové RNA

Vysoce purifikovanou a vysoce kvalitní celkovou RNA lze získat z různých kultivovaných buněk za 11 minut.

Animal Total RNA Isolation Kit

Rychle a efektivně extrahujte vysoce čistou a vysoce kvalitní celkovou RNA z různých živočišných tkání.

Spektrofotometr:

Spektrofotometr se používá hlavně ke stanovení koncentrace a čistoty RNA, ale nedokáže detekovat integritu RNA a genomového zbytku.Mezi nimi jsou A260/280 a A260/230 důležité parametry pro detekci čistoty RNA a čistotu RNA lze detekovat podle kolísání jejich hodnot:

1. 1,9 < A260/280 < 2,1, což ukazuje, že čistota RNA je dobrá;A260/280 <1,9, což naznačuje, že v RNA může být proteinový zbytek;A260/280>2.1, což ukazuje na možnou částečnou degradaci RNA, která může být dále potvrzena elektroforézou na agarózovém gelu.

2. 2,0 < A260/230 < 2,2, což ukazuje, že čistota RNA je dobrá;A260/230 < 2,0, což naznačuje, že v RNA mohou být zbytky organických činidel, jako jsou fenoly, ethanol nebo cukry.

Elektroforéza na agarózovém gelu:

Elektroforéza na agarózovém gelu může analyzovat integritu RNA, genomové a proteinové zbytky, ale nemůže přesně kvantifikovat koncentraci RNA nebo detekovat zbytky organických činidel.Vezměte si například eukaryotické RNA templáty:

1. RNA byla podrobena elektroforéze na agarózovém gelu.Pokud byly na gelové mapě pouze tři jednotlivé pruhy 28sRNA, 18sRNA a 5,8sRNA, znamená to, že extrahovaná RNA je intaktní.Pokud dojde k přetahování, znamená to částečnou degradaci RNA.

2. Pokud je mezi lepidlem a proužkem 28sRNA jediný světlý proužek, může tam být zbytek genomové DNA.

3. Pokud se v otvoru lepidla objeví proužky, znamená to, že tam mohou být zbytky bílkovin a jiných makromolekulárních látek.

Ⅱ. Reverzní transkripce

Po dokončení extrakce RNA je třeba ji přeměnit na cDNA pro následující experimenty, takže krok obrácení je nezbytný.Reverzní transkripce bude zavedena z výběru reverzní transkriptázy a primeru:

Výběr reverzní transkriptázy:

Typické reverzní transkriptázy zahrnují AMV RTázu a MMLV RTázu.RNáza H AMV RTázy má silnou aktivitu, krátkou délku syntézy, nízké množství syntézy a dobrou tepelnou stabilitu (42 ~ 55 °C).Aktivita RNázy H MMLV RTázy je slabá, délka syntézy je dlouhá, množství syntézy je vysoké a tepelná stabilita je špatná (37 ~ 42 °C).

Protože enzym RNáza H má funkci degradace templátu RNA, měly by být při reverzní transkripci přednostně selektovány MMLV se slabou aktivitou RNázy H a po pozdějším genetickém inženýrství dosáhla tepelná stabilita MMLV kvalitativního skoku.Užívání ForegeneForeasy reverzní transkriptáza (M-MLV pro reverzní transkripci) jako příklad je to nová reverzní transkriptáza exprimovaná v E. coli upravených bakteriích za použití technologie genetické rekombinace.Jedná se o rekombinantní DNA polymerázu, která syntetizuje komplementární řetězec DNA z jednořetězcové RNA, DNA nebo hybridu RNA:DNA.Nemá žádnou aktivitu RNázy H, silnou stabilitu, silnou afinitu k RNA a vysokou citlivost detekce.

 

Foreasy reverzní transkriptáza (M-MLV pro reverzní transkripci)

Výběr základního nátěru:

Obecně RT primery spadají do tří kategorií: oligo dT, náhodné primery a genově specifické primery.Vyberte vhodné primery pro použití podle různých experimentálních požadavků.

1. Pokud je templát eukaryotického původu a pozdní cDNA se používá pro rutinní PCR amplifikaci, doporučuje se Oligo (dT);Pokud je následný experiment použit pouze pro qPCR, doporučuje se smíchat Oligo (dT) s náhodnými primery pro zlepšení účinnosti reverzní transkripce.

2. Pokud je templát z prokaryot, měly by být pro reverzní transkripci vybrány náhodné primery nebo genově specifické primery.

Ⅲ.qPCR

Fluorescenční kvantifikace je zpracována především z výběru kvantitativních metod, principů návrhu primerů, výběru ROX, konfigurace reakčního systému a nastavení reakčních podmínek atd.

Výběr kvantitativních metod:

Kvantitativní metody se dělí na metody relativní kvantitativní a metody absolutní kvantitativní.Relativní kvantifikaci lze použít k detekci vlivu určitých léčebných metod na expresi genů, k detekci rozdílu v expresi genů v různých časech a k porovnání rozdílu v expresi genů v různých tkáních.Absolutní kvantifikace může detekovat množství nukleové kyseliny ve viru a tak dále.Při provádění experimentů musíme zvolit vhodné kvantitativní metody podle vlastních experimentů.

Principy návrhu základního nátěru:

Návrh primeru pro qPCR přímo souvisí s účinností amplifikace a specificitou produktu.Správné navržení dobrých primerů je proto prvním krokem úspěšné qPCR.Při návrhu základního nátěru je třeba při splnění principu konvenčního návrhu základního nátěru věnovat pozornost následujícím zásadám:

1. Délka cílového fragmentu je řízena mezi 100 a 300 bp;

2. Cross-exon design, aby se zabránilo vlivu genomové DNA;

3. Navržené primery je třeba testovat na účinnost amplifikace a teprve když účinnost amplifikace dosáhne standardu (90-110 %), mohou být použity pro kvantitativní experimenty;

4. Koncentrace primeru je obvykle optimalizována mezi 0,1 uM a 1,0 uM.

VýběrROX:

V procesu kvantitativní reakce může ROX rovnoměrně upravit rozdíl optické dráhy, chybu pipetování nebo rozdíl objemu způsobený odpařováním a kondenzací, čímž zlepšuje opakovatelnost výsledků.Je však třeba poznamenat, že výběr ROX souvisí s nástrojem.Pokud má přístroj qPCR funkci automatické korekce rozdílu mezi otvory, není nutné přidávat ROX;jinak je potřeba přidat korekci ROX.Malí partneři při nákupu reagencií musí podle použitého přístroje vybrat správný ROX, vyvarovat se pozdějších chyb.

Příprava reakčního systému:

Výhodné jsou reakční objemy 20 ul a 50 ul.Při vytváření systému je třeba věnovat pozornost následujícím věcem:

1. Reakční systém musí být připraven ventilací v ultračistém pracovním stole, nový ddH₂O se používá pro každý experiment;

2. Každý experiment musí připravit NTC, aby se ověřilo, zda je v systému znečištění, a každý pár primerů musí provést NTC při přípravě systému;

3. Pro detekci, zda je v RNA templátu zbytek gDNA, lze pro každý vzorek pro detekci připravit NRT;

4. Při přípravě systému se doporučuje provést alespoň 3 technická opakování pro jeden vzorek;

5. Pokud je templátem cDNA, doporučuje se naředit 5-10krát, aby se snížil inhibiční účinek systému reverzní transkripce na experiment qPCR.Je lepší prozkoumat množství šablony pomocí gradientu, aby hodnota CT spadala mezi 20-30;

6. Určete požadovaný počet reakcí, zvyšte o 5-10 % na základě počtu reakcí a vypočítejte číslo konfigurace objemu;

7, systém je připraven pomocí principu premixu, míchání po odstředění a zajištění bez bublin;

8, Pokud je to možné, zvolte podpůrný spotřební materiál.

Související sada RT-qPCR