Specifičnost detekce
Ve většině případů je účelem návrhu primeru maximalizovat specificitu PCR.To je určeno více či méně předvídatelným vlivem mnoha proměnných.Jednou z důležitých proměnných je sekvence na 3' konci primeru.
Důležité je, že PCR testy navržené pro specificitu si s větší pravděpodobností udrží vysokou účinnost v širokém dynamickém rozsahu, protože test neprodukuje nespecifické amplifikační produkty, čímž soutěží s PCR reagenciemi nebo inhibuje hlavní amplifikační reakci.
Samozřejmě, v některých případech není specifičnost nejdůležitější, například když je cílem kvantifikovat blízce příbuzné, ale různé patogeny, jsou vyžadovány speciální návrhové, optimalizační a ověřovací standardy.
Křivka tání je standardní metodou pro hodnocení specifičnosti amplikonů, alespoň pokud jde o to, zda amplifikovat jeden cíl.Je však třeba zdůraznit, že křivky tání mohou být zavádějící, protože mohou být například ovlivněny kombinovanými účinky suboptimálních primerů a nízkých koncentrací templátu.
P5 |Křivka tání ukazuje posuny Tm získané ze dvou detekcí různých množství dvou cílových DNA.
A. Při vyšších koncentracích (ad) není po dokončení měření qPCR žádný zřejmý dimer primeru.Jak koncentrace templátu klesá na 50 kopií (e), začíná se objevovat nespecifický produkt a stává se jediným produktem s nejnižší koncentrací (f).
B. Test zaznamenal stejné Tms při všech cílových koncentracích a ani při nejnižší koncentraci (5 kopií) nebyl žádný zřejmý dimer primeru.Při použití těchto dvou detekčních metod nebyly v NTC detekovány žádné amplifikační produkty.
P5 ukazuje křivky rozpouštění získané se vzorky, ve kterých je templát přítomen v různých koncentracích.P 5a ukazuje, že při dvou nejnižších koncentracích jsou Tms produkovaných nespecifických amplifikačních produktů nižší než u specifických amplikonů.
Je zřejmé, že tato metoda detekce nemůže být spolehlivě použita k detekci cílů, které existují v nízkých koncentracích.
Je zajímavé, že NTC, tj. vzorky bez DNA vůbec, nezaznamenaly (nespecifické) amplifikační produkty, což ukazuje, že pozadí genomové DNA se může účastnit nespecifické amplifikace/polymerizace.
Někdy takové primery pozadí a nespecifickou amplifikaci nelze napravit, ale často je možné navrhnout metodu detekce, která nemá nespecifickou amplifikaci v žádné koncentraci templátu a NTC (P 5b).
Zde dokonce záznam amplifikace cílové koncentrace s Cq 35 vytvoří specifickou křivku rozpouštění.Podobně NTC nevykazovaly žádné známky nespecifické amplifikace.Někdy může být detekční chování závislé na matečném louhu a v určitých složeních pufru je detekována pouze nespecifická amplifikace, která může souviset s různými koncentracemi Mg2+.
Stabilita detekce
Optimalizace Ta je užitečným krokem v empirickém ověřování a optimalizačním procesu detekce qPCR.Poskytuje přímou indikaci robustnosti sady primerů zobrazením teploty (nebo teplotního rozsahu), která produkuje nejnižší Cq bez zesílení NTC.
Dvoj až čtyřnásobný rozdíl v citlivosti nemusí být důležitý pro lidi s vysokou expresí mRNA, ale pro diagnostické testy může znamenat rozdíl mezi pozitivními a falešně negativními výsledky.
Vlastnosti Ta qPCR primerů se mohou značně lišit.Některé testy nejsou příliš robustní, a pokud nejsou prováděny při optimální hodnotě Ta roznětek, rychle se zhroutí.
To je důležité, protože tento typ detekce je v reálném světě často problematický a čistota vzorku, koncentrace DNA nebo přítomnost jiné DNA nemusí být optimální.
Kromě toho se počet cílových kopií může lišit v širokém rozsahu a činidla, plastové náčiní nebo nástroje se mohou lišit od těch, které byly použity při nastavování testu.
P6|Teplotní gradient ukazuje různou robustnost detekce PCR.
A. Použijte Mastermix Sensifast SYBR od Bioline (katalogové číslo BIO-98050) k provedení PCR na cDNA připravené z RNA lidského mozku.
B. Pomocí přístroje Bio-Rad CFX qPCR zaznamenejte amplifikační mapu a křivku rozpouštění apalenu (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGGTGATCTCCTAGG).
C. Graf amplifikace a křivka tání ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGTCTTGACTCAG).
D. Graf amplifikace a křivka rozpouštění GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCCTCCTCGTGGATCTTC).
E. Cqs zaznamenané při různých teplotách žíhání, ukazující rozdíl v Cq zaznamenaný při teplotním gradientu 7C.
P 6 ukazuje typický výsledek nežádoucího testu, kde byla qPCR provedena s použitím gradientu Tas mezi 59C a 67C (P 6a), s použitím primerů pro tři geny specifické pro lidský mozek.
Z grafu amplifikace je vidět, že primery Opalin nejsou zdaleka ideální, protože jejich optimální rozsah Ta je velmi úzký (obrázek 6b), to znamená, že Cq jsou široce rozptýlené, což vede k tomu, že Cq jsou významně srovnávány s jejich optimálním Cqs Low.
Tato metoda detekce je nestabilní a může vést k suboptimální amplifikaci.Proto by měl být tento pár primerů přepracován.Navíc analýza křivky tání (vložka) ukazuje, že specifičnost této detekční metody může být také problematická, protože křivka tání každého Ta je odlišná.
Metoda detekce ACSBG1 uvedená v P 6c je robustnější než metoda detekce Opalin výše, ale stále má daleko k ideálu a je pravděpodobné, že ji lze zlepšit.
Zdůrazňujeme však, že neexistuje žádná nezbytná souvislost mezi robustností a specificitou, protože disoluční křivka vytvořená touto detekční metodou ukazuje stejnou maximální hodnotu ve všech Tas (vložka).
Na druhou stranu je test robustnosti mnohem tolerantnější a produkuje podobné Cq v širokém rozsahu Tas, jako v testu GFAP uvedeném v P 6d.
Rozdíl v Cqs získaných ve stejném rozsahu 8 stupňů Celsia je menší než 1 a křivka rozpouštění (vložka) potvrzuje detekční charakteristiky v tomto teplotním rozsahu.Stojí za zmínku, že vypočítaný Tas a skutečný rozsah Ta se mohou velmi lišit.
Existuje mnoho pokynů navržených tak, aby pomohly výzkumníkům navrhnout účinné primery, z nichž většina je založena na dlouho zavedených pravidlech a velká pozornost byla věnována 3′konci primerů.Často se doporučuje zahrnout G nebo C na 3' konci a dvě G nebo C báze (GC svorka), ale ne více než dvě z posledních 5 bází.
V praxi mohou tato pravidla vést výzkumníky, ale nemusí být za všech okolností nutně správná.
P7 |3'konec primeru má malý vliv na specificitu nebo účinnost.
A. Poloha primerů pro lidský gen HIF-la (NM_181054.2).
B. Použijte Agilent Brilliant III SYBR Green matečný louh (kat. č. 600882) k amplifikaci šesti testovaných položek.
C. Graf amplifikace a křivka tání zaznamenané přístrojem Bio-Rad CFX qPCR a 3'koncovými primery.NTC jsou zobrazeny červeně.
D. Záznam Cqs každého testovaného předmětu
Například výsledek v P 7 odporuje pravidlu 3′konce.Všechny návrhy poskytují v podstatě stejné výsledky, pouze dvě kombinace primerů vedou k nespecifické amplifikaci v NTC.
Nemůžeme však podpořit efekt GC klipu, protože v tomto případě použití A nebo T jako maximálně 30 bází nesnižuje specificitu.
Test C, kde F primer končí v GGCC, zaznamenal Cqs v NTC, což naznačuje, že by se mohlo chtít vyhnout se těmto sekvencím na 30-konci.Zdůrazňujeme, že jediný způsob, jak určit nejlepší 3'koncovou sekvenci páru primerů, je experimentálně vyhodnotit některé kandidátní primery.
Účinnost zesílení
Důležité je, že i když se nespecifická PCR detekce nikdy nemůže stát specifickou, účinnost amplifikace lze upravit a maximalizovat mnoha různými způsoby změnou enzymu, matečného louhu, aditiv a podmínek cyklování.
K vyhodnocení účinnosti detekce PCR je nejlepší použít sériové ředění 10 nebo 5 násobku cílové nukleové kyseliny, tedy „metodu standardní křivky“.
Pokud jsou pro vytvoření standardní křivky použity PCR amplikony nebo syntetické cíle DNA, sériová ředění těchto cílů by měla být smíchána s konstantním množstvím základní DNA (jako je genomová DNA).
P8 |Křivka ředění pro vyhodnocení účinnosti PCR.
A. Použijte primery pro HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA a R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC a Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (katalogové číslo 600882) pro podmínky PCR a křivky tání.
B. 100 ng RNA bylo reverzně transkribováno, 2krát zředěno a sériově zředěné vzorky cDNA byly ředěny 5krát na 1 ng lidské genomové DNA.Křivka tání je uvedena v příloze.
C. RT reakce, ředění a sériové ředění byly opakovány pro druhý vzorek cDNA a výsledky byly podobné.
P 8 ukazuje dvě standardní křivky, při použití stejné detekční metody na dvou různých vzorcích cDNA, výsledkem je stejná účinnost, asi 100 %, a podobná je i hodnota R2, tedy míra shody mezi experimentálními daty a regresní přímkou nebo mírou linearity dat.
Tyto dvě standardní křivky jsou srovnatelné, ale nejsou úplně stejné.Pokud je účelem přesně kvantifikovat cíl, je třeba poznamenat, že je nepřijatelné poskytovat výpočet počtu kopií bez vysvětlení nejistoty.
P9 |Nejistota měření spojená s kvantifikací pomocí standardní křivky.
A. Použijte primery pro GAPDH (NM_002046) k provedení podmínek PCR a křivky tání.F: ACAGTTGCCATGTAGACC a R: TAACTGGTTGAGCACAGG a Mastermix Sensifast SYBR od Bioline (katalogové číslo BIO-98050).
B. Graf amplifikace, křivka tání a standardní křivka zaznamenané přístrojem Bio-Rad CFX qPCR.
C. Graf standardní křivky a 95% interval spolehlivosti (CI).
D. Počet kopií a 95% interval spolehlivosti tří hodnot Cq odvozených z křivky ředění.
P 9 ukazuje, že pro optimalizovaný test je inherentní variabilita jedné standardní křivky přibližně dvojnásobná (95% interval spolehlivosti, minimum až maximum), což může být nejmenší variabilita, kterou lze očekávat.
Podobný produkt:
Čas odeslání: 30. září 2021
