Všichni mluví o principu experimentu qRT-PCR, návrhu primeru, interpretaci výsledků atd., ale myslím, že bych se s vámi měl podělit o experimentální fungování qRT-PCR.Je to malé, ale jde o výsledky.
Než provedeme qRT-PCR, musíme mít jasnou představu o naší vlastní RNA a operačních metodách.Koneckonců, naše úsilí je zaměřeno spíše na dosažení výsledků než na pouhé cvičení.Než tedy provedeme qRT-PCR, musíme určit následující problémy (z nichž některé jsou použitelné pouze pro SYBR).
1 Jste si jistý, že vaše RNA není degradována?
NanoDrop 2000 dokáže detekovat pouze koncentraci a čistotu RNA, ale nedokáže detekovat integritu RNA.
Hodnota RNA (RNA Intesity Number) může odrážet integritu RNA, která je detekována systémem Agilent 2100 Bioanalyzer.
Obr Schematický diagram hodnot RIN pro různé vzorky RNA (eukaryota) Obr.
Laboratoře však obecně nemají Agilent 2100 Bioanalyzer.V tomto případě můžeme detekovat přes formaldehydový gel, ale požadavek na celkové množství RNA je vysoký, takže nejrychlejší metodou je použití běžné gelové elektroforézy.Je vyžadováno, aby byl v prostředí bez nukleáz, proto je nutné vypláchnout elektroforézní nádrž, sol láhev, gelový držák a hřeben vodou DEPC.Agaróza je také bez nukleáz (pokud je čerstvě otevřená) a nakládací pufr by měl být co nejvíce čerstvě otevřen, s 1,2% gelem.
Všimněte si, že gel musí být zcela rozpuštěn, jinak způsobí nehomogenní pásy, jak je znázorněno na obrázku 9.Pokud je napětí příliš vysoké nebo běží příliš dlouho, bude generovat teplo a způsobí degradaci RNA, takže napětí a čas by měly být řízeny rozumně.Kromě toho může běh gelu dále určit, zda je ve vzorku zbytky DNA, a sledovat, zda je v dávkovací jamce velký počet zadržených proužků.
Postava.Detekce RNA gelovou elektroforézou
2 Jste si jisti koncentrací vaší cDNA?
Zkušenost velkých bratrů v laboratoři je taková, že cDNA 20 ul systému získaná každou inverzí se přímo ředí 20X, zatímco postdoktorské sestry se ředí 10X.Obvykle jsem závislý na situaci.Protože kvalita RNA zmiňovaná každým člověkem je jiná, úroveň reverze je také různá a technologie reverze nemusí být stabilní.
Takže pokaždé, když dostanu reverzní cDNA, nejprve ji asi 3krát naředím a poté použiji housekeeping gen k provedení RT-PCR, počet cyklů je obecně 25 cyklů, k identifikaci konkrétní koncentrace a pak určím konečný faktor ředění.
3 Jste si jisti, že se vaše primery snadno používají?
Může projít křivkou tání qRT-PCR, ale stále to stojí peníze.Pro laboratoře bez spousty peněz, když dostanou mnoho primerů, mohou použít obyčejnou RT-PCR, aby zjistili, zda se jedná o jeden pás a identifikovali specifičnost primerů.Pokud laboratoř nemá nedostatek peněz, lze specifičnost všech primerů jednou identifikovat pomocí křivky tání.
4 Jste si jisti, že vaše experimentální podmínky jsou vhodné?
SYBR by měl být chráněn před silným světlem, proto se pokuste při přidávání činidla SYBR vypnout stropní světlo a k dokončení stačí použít tlumené světlo.
Skladujte SYBR při 4°C.Při použití jemně obracejte nahoru a dolů, aby se dobře promíchalo, aby nedošlo k tvorbě pěny, a nevortexujte prudce.
Některé mladší sestry rády kreslí značky na tabuli PCR ze strachu, že si vzorky pomíchají, což je špatně.Protože vaše markery velmi pravděpodobně ovlivní sběr fluorescenčních signálů, obecně doporučuji juniorům používat experimentální notebooky, které jim pomohou s pamětí, jak je uvedeno níže.
Postava.Schéma načítání vzorků qRT-PCR
5 Jste si jistý, že to děláte správně?
Nezapomeňte nosit rukavice, nosit rukavice, nosit rukavice a třikrát říkat důležité věci.
Abychom omezili vystavení SYBR světlu, osobně bych nejprve rád přidal šablonu, jak je znázorněno na obrázku níže.Podle zkušeností může přidání malého množství šablony způsobit chyby ve vzorkování.Proto, abych minimalizoval chybu způsobenou přidáním malého množství šablony, obvykle vzorek znovu zdvojnásobím a při přidávání zdvojnásobím množství, abych snížil množství přidané H2O2.
Postava.Schéma načítání qRT-PCR
Poté nakonfigurujte systém qRT-PCR následovně.
Postava.Schéma přípravy systému qRT-PCR
POZNÁMKA: Proces konfigurace je třeba provést na ledu.
Po přidání vzorku přilepte průhlednou těsnící fólii.Snažte se nedotýkat se rukama povrchu průhledné uzavírací fólie, pouze ovládejte z prostoru na obou stranách fólie.Protože otisky prstů mohou také ovlivnit sběr fluorescenčních signálů.Poté pomocí centrifugy rychle odstřeďujte po dobu 10 s při nízké rychlosti, aby vzorek nevisel na stěně.
Související produkty:
Čas odeslání: 28. dubna 2023
