RT-qPCR je základní experiment molekulární biologie a každý s ním musí být obeznámen.Zahrnuje především tři kroky: extrakci RNA, reverzní transkripci do cDNA a fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase.Nepomáhá to, co se děje?Je pravděpodobné, že je problém sexperiment s reverzní transkripcí!I když se zdá, že experiment s reverzní transkripcí potřebuje pouze přidat RNA, dNTP, primery areverzní transkriptázydo centrifugační zkumavky a dobře promíchejte, ale ve skutečném provozním procesu je stále mnoho detailů, kterým je třeba věnovat pozornost.Pojďme se o tom dozvědět!

Jak posoudit kvalitu RNA?
Pro získání cDNA je kritická kvalita RNA!Kvalitu RNA lze zjistit především ze dvou hledisek:
(1) Integrita RNA:Integritu RNA lze ověřit elektroforézou na agarózovém gelu. Vezmeme-li jako příklad eukaryota, kompletní celková RNA má tři jasné pásy, molekulové hmotnosti od velkých po malé jsou 28S, 18S a 5S a 28S je dvakrát jasnější než 18S;pokud jsou vidět tři pruhy, ale typ pruhu je rozmazaný nebo difúze znamená, že RNA je částečně degradována.V tuto chvíli prosím proveďte reverzní transkripční reakci okamžitě a přiměřeně zvyšte vstup šablony;pokud je vidět pouze pás s malou molekulovou hmotností nebo žádný pás, RNA byla zcela degradována a je třeba ji znovu extrahovat.Agilent 2100 indikuje integritu RNA s diagramem píku a hodnotou RIN.Pokud je nukleová kyselina intaktní, základní linie elektroferogramu je plochá;pokud je nukleová kyselina vážně degradována, základní linie je nerovnoměrná a objevuje se více degradačních píku;hodnota RIN odráží integritu RNA, v rozmezí 0-10, čím větší hodnota, tím lepší kvalita RNA.Čím vyšší je stupeň úplnosti.
(2) Čistota RNA:Poměr OD260/280 lze detekovat UV spektrofotometrií.Pokud je poměr OD260/280 mezi 1,9 a 2,1, je čistota velmi dobrá.
Zbytková genomová DNA může vést k nepřesným kvantitativním výsledkům
Když je RNA extrahována, získaná RNA může být smíchána s genomickou DNA (gDNA), která nebyla vyčištěna.Proto bude cDNA po reverzní transkripci také smíchánagDNA.Během po prouduqPCRreakce,cDNAa gDNA mohou být amplifikovány současně, což vede k relativně nízké hodnotě CT, takže výsledky mohou být zkreslené.
Co bychom tedy měli v této situaci dělat?Foregenenavrhuje:
(1) Proveďte čištění genomu na reverzní RNA, kterou lze odstranit extrakcí z kolony během extrakce RNA;
(2) Ošetřete extrahovanou RNA DNázouI , ale ukončete jej pomocí EDTA;
reverzních transkripčních činidels moduly pro čištění genomu;

Jak vybrat primery pro reverzní transkripci?
Reverzní transkripční primery také ovlivňují výsledek reverzní transkripční reakce.Pro reverzní transkripci si můžete vybrat náhodné primery, Oligo dT nebo genově specifické primery podle konkrétních okolností experimentu:
(1) Specifické přepisy: doporučují se genově specifické primery;
(2) Transkripty dlouhých fragmentů: Doporučují se primery Oligo dT/genově specifické;
(3) Vnitřní fragmenty transkriptů dlouhých segmentů: genově specifické primery/náhodné primery/náhodné primery + Oligo dT.Pokud se provede následný experiment qPCR, Oligo dT nelze použít samostatně, protože použití samotného Oligo dT může způsobit zkreslení 3' konce, což vede k nepřesným výsledkům experimentu qPCR;
(4) miRNA: Lze použít primery s kmenovou smyčkou nebo primery na ocásky.

Kolikrát by měla být cDNA produktu reverzní transkripce zředěna pro kvantifikaci?
Po získání cDNA produktu reverzní transkripce je velmi důležité, kolikrát by měla být cDNA naředěna pro experimenty qPCR.Pokud je koncentrace cDNA příliš vysoká nebo příliš nízká, může být ovlivněna účinnost amplifikace.Lze měřit koncentraci cDNA a jak by se to mělo dělat?
(1) Koncentraci cDNA produktu reverzní transkripce nelze měřit, protože kromě produktu cDNA obsahuje produkt reverzní transkripce také zbytkový pufr reverzní transkripce, reverzní transkriptázu, primery atd., které budou interferovat s výsledky měření koncentrace a způsobí abnormální výtěžek OD260/280, OD260/230, a proto neodráží skutečný poměr cDNA.V tuto chvíli někteří přátelé řeknou, pak změřím koncentraci po čištění;zde by Foregene rád připomněl, že cDNA se nedoporučuje purifikovat, protože délka cDNA získaná reverzí je různá a krátká cDNA se při čištění ztratí.
(2) Co tedy dělat?Před experimentem qPCR může být gradient ředění cDNA stanoven prostřednictvím předexperimentu.Například: použijte zásobní roztok cDNA, 10násobné ředění a 100násobné ředění jako šablony pro experimenty qPCR a vyberte faktor ředění s hodnotou CT v rozmezí 18-28.

Jak by měly být miRNA reverzně transkribovány?
miRNA je jednovláknová malá molekula RNA o velikosti asi 22 nt, která nekóduje protein.Vzhledem ke své krátké délce je konvenční metoda qPCR obtížné ji přímo kvantifikovat, takže je často nutné rozšířit miRNA;běžně používané metody reverzní transkripce pro miRNA zahrnují metodu stem-loop a metodu tailing.
Metoda vlásenkové smyčky spočívá v rozšíření miRNA přidáním primerů se vlásečkovou smyčkou.Tato metoda detekce má vyšší citlivost a specificitu, ale propustnost detekce je nízká.Jedna reverzní transkripce může detekovat pouze jednu miRNA a vnitřní referenci;metoda přidávání ocasu se skládá ze dvou Je dokončena společným působením dvou enzymů, kterými jsou PolyA polymeráza a reverzní transkriptáza.PolyA polymeráza je zodpovědná za přidání PolyA konců k miRNA, aby se zvýšila její délka, a reverzní transkriptáza provádí reverzní transkripční reakci.Tato metoda má vysokou propustnost detekce a dokáže detekovat více miRNA a interních referencí v jedné reverzní transkripci, ale senzitivita a specificita jsou u metody stem-loop nízká.