Fluorescenční kvantitativní PCR (také známá jako TaqMan PCR, dále jen FQ-PCR) je nová kvantitativní technologie nukleových kyselin vyvinutá společností PE (Perkin Elmer) ve Spojených státech v roce 1995. Tato technologie je založena na konvenční PCR přidáním fluorescenčně značených sond.Ve srovnání s flexibilní PCR má FQ-PCR mnoho výhod pro realizaci své kvantitativní funkce.Tento článek má v úmyslu stručně popsat vlastnosti, principy, metody a aplikace této technologie.
1 Vlastnosti
FQ-PCR má nejen vysokou citlivost běžné PCR, ale také díky použití fluorescenčních sond dokáže přímo detekovat změnu fluorescenčního signálu během amplifikace PCR prostřednictvím systému fotoelektrické vodivosti pro získání kvantitativních výsledků, které překonávají mnohé nedostatky konvenční PCR, takže má také vysokou specificitu hybridizace DNA a vysokou přesnost spektroskopické technologie.
Například obecné produkty PCR je třeba pozorovat elektroforézou na agarózovém gelu a barvením ethidium bromidem ultrafialovým světlem nebo elektroforézou na polyakrylamidovém gelu a barvením stříbrem.To vyžaduje nejen více nástrojů, ale také čas a úsilí.Použité skvrny Ethidium bromid je škodlivý pro lidské tělo a tyto komplikované experimentální postupy poskytují příležitosti ke znečištění a falešným pozitivním výsledkům.FQ-PCR však potřebuje během vkládání vzorku otevřít víko pouze jednou a následným procesem je operace se zcela uzavřenou zkumavkou, která nevyžaduje následné zpracování PCR, čímž se vyhnete mnoha nevýhodám konvenčních operací PCR.Experiment obecně používá termální cyklovač ABI7100 PCR vyvinutý společností PE.
Přístroj má následující vlastnosti: ① Široké použití: Může být použit pro kvantifikaci DNA a RNA PCR produktů, výzkum genové exprese, detekci patogenů a optimalizaci podmínek PCR.② Jedinečný kvantitativní princip: Při použití fluorescenčně značených sond se množství fluorescence nahromadí s cyklem PCR po excitaci laserem, aby bylo dosaženo účelu kvantifikace.③ Vysoká pracovní účinnost: Vestavěný termocykler 9600 PCR, počítačem řízený 1 až 2 hodiny k dokončení amplifikace a kvantifikace 96 vzorků automaticky a synchronně.④ Není potřeba gelová elektroforéza: Není třeba ředit a elektroforézovat vzorek, stačí použít speciální sondu k detekci přímo v reakční zkumavce.⑤ Žádné znečištění v potrubí: Jedinečná plně uzavřená reakční trubice a systém fotoelektrického vedení jsou přijaty, takže se nemusíte obávat znečištění.⑥Výsledky jsou reprodukovatelné: kvantitativní dynamický rozsah je až pět řádů.Proto, protože byla tato technologie úspěšně vyvinuta, byla oceněna mnoha vědeckými výzkumníky a byla aplikována v mnoha oblastech.
2 Principy a metody
Princip činnosti FQ-PCR spočívá ve využití 5′→3′ exonukleázové aktivity enzymu Taq k přidání fluorescenčně značené sondy do reakčního systému PCR.Sonda může specificky hybridizovat s templátem DNA obsaženým v sekvenci primeru.5′konec sondy je označen fluorescenčním emisním genem FAM (6-karboxyfluorescein, fluorescenční emisní vrchol při 518nm) a 3′konec je označen skupinou zhášející fluorescenci TAMRA (6-karboxytetramethylrhodamin, pík fluorescenční emise při 582nm je zabráněno vzniku 3′probein a fosfo zesílení.Když sonda zůstane nedotčena, zhášecí skupina potlačí fluorescenční emisi emitující skupiny.Jakmile je emitující skupina oddělena od zhášecí skupiny, inhibice je zrušena a optická hustota při 518nm se zvyšuje a je detekována fluorescenčním detekčním systémem. Ve fázi renaturace sonda hybridizuje s templátovou DNA a enzym Taq v extenzní fázi se pohybuje podél templátu DNA s prodloužením primeru.Když je sonda odříznuta, uvolní se zhášecí efekt a uvolní se fluorescenční signál.Pokaždé, když je šablona zkopírována, je sonda odříznuta, doprovázená uvolněním fluorescenčního signálu.Protože existuje vztah jedna ku jedné mezi počtem uvolněných fluoroforů a počtem produktů PCR, lze tuto techniku použít k přesné kvantifikaci templátu.Experimentální přístroj obecně používá termocykler ABI7100 PCR vyvinutý společností PE a lze použít i jiné termocyklery.Pokud se pro experiment použije reakční systém typu reakce ABI7700, po dokončení reakce lze kvantitativní výsledky přímo poskytnout pomocí počítačové analýzy.Pokud používáte jiné termocyklery, musíte použít fluorescenční detektor pro měření fluorescenčního signálu v reakční zkumavce současně pro výpočet RQ+, RQ-, △RQ.RQ+ představuje poměr intenzity luminiscence fluorescenční emisní skupiny zkumavky se vzorkem k intenzitě luminiscence zhášecí skupiny, RQ- představuje poměr dvou v prázdné zkumavce, △RQ (△RQ=RQ+-RQ-) představuje míru změny fluorescenčního signálu během PCR Po zpracování dat lze získat kvantitativní výsledky.Díky zavedení fluorescenčních sond se výrazně zlepšuje specifičnost experimentu.Konstrukce sondy by měla obecně splňovat následující podmínky: ①Délka sondy by měla být asi 20-40 bází, aby byla zajištěna specifičnost vazby.②Obsah GC bází je mezi 40 % a 60 %, aby se zabránilo duplikaci jednotlivých nukleotidových sekvencí.③ Vyhněte se hybridizaci nebo překrývání s primery.④ Stabilita vazby mezi sondou a templátem je větší než stabilita vazby mezi primerem a templátem, takže hodnota Tm sondy by měla být alespoň o 5 °C vyšší než hodnota Tm primeru.Kromě toho má na výsledky experimentu vliv koncentrace sondy, homologie mezi sondou a templátovou sekvencí a vzdálenost mezi sondou a primerem.
Související produkty:
Čína Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman výrobce a dodavatel |Foregene (foreivd.com)
Čas odeslání: 15. října 2021
