RNáza je citlivé slovo, které mnoho studentů, kteří často provádějí experimenty s extrakcí RNA, nechce slyšet.Plně vyzbrojená RNA, která byla nakonec extrahována vysoce toxickými činidly fenolem a chloroformem, byla degradována.Nejsem smířená!!!Dnes se podíváme na původ slavného Rnase.

Ribonukleáza (RNáza) nebo RNáza je nukleáza, která dokáže hydrolyzovat RNA na malé molekuly.RNáza, jako protein s malou molekulou, je neobvykle stabilní .Konvenční vysokoteplotní a vysokotlaká parní sterilizace a proteinové inhibitory jej nedokážou zcela inaktivovat.Stabilita RNázy pochází hlavně z disulfidových vazeb ve struktuře.Například běžně používaná RNáza hovězí slinivky má pouze 124 aminokyselin, ale obsahuje 4 disulfidové vazby.Sirná vazba a disulfidová vazba dodávají RNáze vynikající tepelnou stabilitu.Kromě toho má rnáza relativně malou molekulovou hmotnost a může v mnoha případech rychle obnovit svou původní konformaci.

Kromě toho, že je extrémně stabilní,RNázy jsou v laboratoři všudypřítomné .RNáza je biologický obranný mechanismus.Pro buňku je exogenní RNA často fatální.Ve srovnání s exogenní DNA je exogenní RNA často nebezpečnější.RNA je šťastně transkribována a překládána, takže téměř všechny organismy vyvinuly RNázy na obranu proti invazi exogenní RNA.Proto bakteriální buňky kultivované v laboratoři a vy, kteří extrahujete RNA, vyzařují aroma RNázy.Lidské tělesné tekutiny (sliny, slzy atd.) obsahují velké množství RNázy, takže při degradaci RNA neplačte.Čím více budete plakat, tím horší bude degradace RNA!!Sestra Daiyu není vhodná pro extrakci RNA!

Kromě toho vaše jemná pokožka obsahuje také mnoho RNázy a značkovače, pipety, dveře chladničky a kliky dveří, kterých se pokožka dotkla, také obsahují RNázu.

S tolika toulkami se pojďme podívat na to, jak se vypořádat s RNasemi.

První věc, která každého napadne při odstraňování RNA, jeDEPC(diethylpyrokarbonát).DEPC hlavně denaturuje protein spojením s imidazolovým kruhem aktivní skupiny RNázy histidinu, čímž inhibuje aktivitu enzymu.0,1% DEPC může mít lepší účinek na odstranění Rnase, ale musíme věnovat pozornost tomu, že DEPC je známý karcinogen, takže při jeho používání je třeba věnovat zvláštní pozornost.

U RNase musíme začít ze dvou aspektů,první je inhibice aktivity endogenní RNázy

Konvenční činidla pro extrakci RNA, jako je guanidinisothiokyanát a DTT obsažená v Trizolu, dokážou otevřít disulfidovou vazbu RNázy, ale stále existují určité RNázy, zejména ve vzorcích tkání, proto dávejte pozor na nízkou teplotu.

1.Vzorek tkáně po vyjmutí ihned ponořte do kapalného dusíku nebo do komerčního roztoku pro konzervaci RNA.

2.Po extrakci RNA buněčného vzorku ji přidejte do lyzačního roztoku a lyzujte na ledové nádobě

3. K broušení je nejlepší použít tekutý dusík když jsou vzorky tkáně homogenizovány.Při použití elektrického homogenizátoru bez kapalného dusíku dbejte na úplné předchlazení adaptéru homogenátu.

Druhým je exogenní DNáza

1.Buďte plně vyzbrojeni, noste laboratorní plášť, noste masku a určitě si vezměte pár nových rukavic (nebuďte tak spořiví!! Nutno podotknout, že Trizol je super žíravý, a je také velmi silný přes rukavice, takže vám nekapejte na ruce).

2.Všechny použité špičky pipet, EP zkumavky, PCR zkumavky a další vybavení musí být ošetřeno deRNázou.Může být namočen v 0,1% DEPC a poté natlakován pod vysokým tlakem.Věnujte pozornost provozu v digestoři.Místní tyrani mohou přímo nakupovat spotřební materiál pro odstraňování enzymů.

PS: Řeknu vám línou metodu.Přestože vysoká teplota a vysoký tlak nedokážou RNázu úplně odstranit, odstraní ji velkou část.2krát vysoká teplota a vysoký tlak má dobrý účinek a extrakce RNA má malý účinek.

3.Alkohol může denaturovat bílkoviny,takže tabulku extrakce RNA lze otřít 75% alkoholem a rukavice lze také nastříkat alkoholem.

4.Konečný roztok rozpouštějící RNA a centrifugační zkumavka by měly být také ošetřeny de-RNázou.DEPC voda je běžně používaný roztok pro rozpouštění RNA.Pojďme si promluvit o správném způsobu přípravy vody DEPC (při nákupu nezapomeňte přebalit komerční DEPC)

Přidejte DEPC do ultračisté vody v poměru 1:1000, dobře protřepejte, nechte stát přes noc při 37 °C a sterilizujte při 121 °C za vysoké teploty a vysokého tlaku po dobu 15 minut.DEPC vodu lze skladovat při -20 °C v 1 ml alikvotech.

Závěrem shrnuto: klíčem je nízká teplota, dobře se manipuluje se spotřebním materiálem, plně vyzbrojení a méně hovorů!

No a to je pro dnešní strategii vše.Přeji vám všem koncentraci a čistotu RNA, kterou jste zmínil.Oba A260/A280 jsou 2.0!!!

Samozřejmě, pokud použijete aSouprava pro extrakci RNA pro provoz při pokojové teplotě, nemusí se s výše uvedenými potížemi setkat.

Provoz při pokojové teplotě, bez přidání DNázy, extrahuje celkovou RNA z buněk za 11 minut a extrahuje celkovou RNA ze zvířecích tkání nebo rostlin za 30 minut.

Pro zkušební vzorky kontaktujte:overseas@foregene.com

Související produkty:

https://www.foreivd.com/cell-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/animal-total-rna-isolation-kit-product/

https://www.foreivd.com/plant-total-rna/