• PCR je metoda používaná k amplifikaci DNA z malého množství templátu DNA.RT-PCR využívá reverzní transkripci k produkci templátu DNA ze zdroje RNA, který pak může být amplifikován.
• PCR a RT-PCR jsou typicky koncové reakce, zatímco qPCR a RT-qPCR používají kinetiku rychlosti syntézy produktu během PCR reakce ke kvantifikaci množství přítomného templátu.
• Novější metody, jako je digitální PCR, poskytují absolutní kvantifikaci výchozího templátu DNA, zatímco metody jako izotermická PCR snižují potřebu drahého vybavení pro poskytování spolehlivých výsledků.

Polymerázová řetězová reakce (PCR) je relativně jednoduchá a široce používaná technika molekulární biologie k amplifikaci a detekci sekvencí DNA a RNA.Ve srovnání s tradičními metodami klonování a amplifikace DNA, které mohou často trvat dny, vyžaduje PCR jen několik hodin.PCR je vysoce citlivá a vyžaduje minimální templát pro detekci a amplifikaci specifických sekvencí.Základní metody PCR dále pokročily od jednoduché detekce DNA a RNA.Níže uvádíme přehled různých metod PCR a činidel, která poskytujeme v Enzo Life Sciences pro potřeby vašeho výzkumu.Naším cílem je pomoci vědcům rychle získat přístup k činidlům PCR, která mohou použít v dalším výzkumném projektu!

PCR

Pro standardní PCR potřebujete pouze DNA polymerázu, hořčík, nukleotidy, primery, templát DNA k amplifikaci a termocykler.Mechanismus PCR je stejně jednoduchý jako jeho účel: 1) dvouřetězcová DNA (dsDNA) je tepelně denaturována, 2) primery se přiřazují k jednotlivým řetězcům DNA a 3) primery jsou prodlouženy DNA polymerázou, což vede ke dvěma kopiím DNA. původní řetězec DNA.Proces denaturace, žíhání a prodloužení v řadě teplot a časů je známý jako jeden cyklus amplifikace (obr. 1).

Každý krok cyklu by měl být optimalizován pro použitou šablonu a sadu primerů.Tento cyklus se opakuje přibližně 20-40krát a amplifikovaný produkt může být poté analyzován, typicky na agarózovém gelu (obr. 2).

Protože PCR je vysoce citlivá metoda a pro jednotlivé reakce jsou vyžadovány velmi malé objemy, doporučuje se připravit hlavní směs pro několik reakcí.Master mix musí být dobře promíchán a poté rozdělen podle počtu reakcí, aby bylo zajištěno, že každá reakce bude obsahovat stejné množství enzymu, dNTP a primerů.Mnoho dodavatelů, jako je Enzo Life Sciences, nabízí také PCR směsi, které již obsahují vše kromě primerů a templátu DNA.

Oblasti bohaté na guanin/cytosin (bohaté na GC) představují výzvu ve standardních technikách PCR.Sekvence bohaté na GC jsou stabilnější než sekvence s nižším obsahem GC.Kromě toho sekvence bohaté na GC mají tendenci tvořit sekundární struktury, jako jsou vlásenkové smyčky.V důsledku toho je obtížné zcela oddělit dvouřetězce bohaté na GC během denaturační fáze.V důsledku toho DNA polymeráza nemůže syntetizovat nový řetězec bez překážek.Vyšší teplota denaturace to může zlepšit a úpravy směrem k vyšší teplotě nasedání a kratší době nasedání mohou zabránit nespecifické vazbě primerů bohatých na GC.Další činidla mohou zvýšit amplifikaci sekvencí bohatých na GC.DMSO, glycerol a betain pomáhají narušit sekundární struktury, které jsou způsobeny interakcemi GC, a tím usnadňují separaci dvou řetězců.

Hot Start PCR

Nespecifická amplifikace je problém, který může nastat během PCR.Většina DNA polymeráz, které se používají pro PCR, funguje nejlépe při teplotách kolem 68 °C až 72 °C.Enzym však může být aktivní i při nižších teplotách, i když v nižší míře.Při teplotách hluboko pod teplotou nasedání se primery mohou vázat nespecificky a vést k nespecifické amplifikaci, i když je reakce nastavena na ledu.Tomu lze předejít použitím polymerázových inhibitorů, které se disociují z DNA polymerázy až po dosažení určité teploty, proto se nazývá hot start PCR.Inhibitorem může být protilátka, která váže polymerázu a denaturuje při počáteční denaturační teplotě (typicky 95 °C).

Vysoce věrná polymeráza

Zatímco DNA polymerázy amplifikují poměrně přesně na původní templátovou sekvenci, může dojít k chybám při párování nukleotidů.Neshody v aplikacích, jako je klonování, mohou vést ke zkráceným transkriptům a chybně translatovaným nebo neaktivním proteinům po směru.Aby se předešlo těmto neshodám, byly identifikovány a začleněny do pracovního postupu polymerázy s činností „korektury“.První korekční polymeráza, Pfu, byla identifikována v roce 1991 u Pyrococcus furiosus.Tento enzym Pfu má 3' až 5' exonukleázovou aktivitu.Jak je DNA amplifikována, exonukleáza odstraňuje nesprávně spárované nukleotidy na 3' konci vlákna.Správný nukleotid je pak nahrazen a syntéza DNA pokračuje.Identifikace nesprávných nukleotidových sekvencí je založena na vazebné afinitě ke správnému nukleosidtrifosfátu s enzymem, kde neefektivní vazba zpomaluje syntézu a umožňuje správné nahrazení.Korekční aktivita Pfu polymerázy má za následek méně chyb v konečné sekvenci ve srovnání s Taq DNA polymerázou.V posledních letech byly identifikovány další korekturní enzymy a byly provedeny modifikace původního Pfu enzymu, aby se dále snížila chybovost během amplifikace DNA.

RT-PCR

Reverzní transkripční PCR nebo RT-PCR umožňuje použití RNA jako templátu.Další krok umožňuje detekci a amplifikaci RNA.RNA je reverzně transkribována do komplementární DNA (cDNA) pomocí reverzní transkriptázy.Kvalita a čistota templátu RNA jsou zásadní pro úspěch RT-PCR.Prvním krokem RT-PCR je syntéza hybridu DNA/RNA.Reverzní transkriptáza má také funkci RNázy H, která degraduje RNA část hybridu.Jednovláknová molekula DNA je pak doplněna DNA-dependentní DNA polymerázovou aktivitou reverzní transkriptázy na cDNA.Účinnost reakce prvního vlákna může ovlivnit proces amplifikace.Od této chvíle se k amplifikaci cDNA používá standardní postup PCR.Možnost revertovat RNA na cDNA pomocí RT-PCR má mnoho výhod a primárně se používá pro analýzu genové exprese.RNA je jednovláknová a velmi nestabilní, což ztěžuje práci s ní.Běžně slouží jako první krok v qPCR, která kvantifikuje RNA transkripty v biologickém vzorku.

qPCR a RT-qPCR

Kvantitativní PCR (qPCR) se používá k detekci, charakterizaci a kvantifikaci nukleových kyselin pro četné aplikace.V RT-qPCR jsou transkripty RNA často kvantifikovány nejprve reverzním přepisem do cDNA, jak je popsáno výše, a poté se následně provádí qPCR.Stejně jako ve standardní PCR je DNA amplifikována třemi opakujícími se kroky: denaturací, žíháním a elongací.V qPCR však fluorescenční značení umožňuje shromažďování dat v průběhu PCR.Tato technika má mnoho výhod díky řadě dostupných metod a chemických látek.

V qPCR na bázi barviva (typicky zelená) umožňuje fluorescenční značení kvantifikaci amplifikovaných molekul DNA pomocí použití barviva vázajícího dsDNA.Během každého cyklu se měří fluorescence.Fluorescenční signál se zvyšuje úměrně s množstvím replikované DNA.DNA je tedy kvantifikována v „reálném čase“ (obr. 3).Nevýhody qPCR na bázi barviva jsou v tom, že lze zkoumat pouze jeden cíl najednou a že se barvivo naváže na jakoukoli ds-DNA přítomnou ve vzorku.

V qPCR založené na sondě lze v každém vzorku detekovat mnoho cílů současně, ale to vyžaduje optimalizaci a návrh sondy specifické pro cíl, která se používá kromě primerů.K dispozici je několik typů provedení sond, ale nejběžnějším typem je hydrolyzační sonda, která obsahuje fluorofor a zhášedlo.Fluorescenční rezonanční přenos energie (FRET) zabraňuje emisi fluoroforu přes zhášeč, když je sonda neporušená.Během PCR reakce je však sonda hydrolyzována během extenze primeru a amplifikace specifické sekvence, na kterou je navázána.Štěpení sondy oddělí fluorofor od zhášeče a má za následek zvýšení fluorescence závislé na amplifikaci (obr. 4).Fluorescenční signál z qPCR reakce založené na sondě je tedy úměrný množství cílové sekvence sondy přítomné ve vzorku.Protože qPCR založená na sondě je specifičtější než qPCR na bázi barviva, je to často technologie používaná v diagnostických testech založených na qPCR.

Izotermické zesílení

Výše uvedené techniky PCR vyžadují drahé termocyklovací zařízení pro přesné zvyšování a snižování teplot komory pro kroky denaturace, žíhání a extenze.Byla vyvinuta řada technik, které nepotřebují tak přesná zařízení a lze je provádět v jednoduché vodní lázni nebo dokonce v zájmových buňkách.Tyto techniky se souhrnně nazývají izotermická amplifikace a pracují na bázi exponenciálního, lineárního nebo kaskádového zesilování.

Nejznámějším typem izotermické amplifikace je smyčkou zprostředkovaná izotermická amplifikace neboli LAMP.LAMP používá exponenciální amplifikaci při 65 °C k amplifikaci templátové DNA nebo RNA.Při provádění LAMP se k syntéze nové DNA používá čtyři až šest primerů komplementárních k oblastem cílové DNA s DNA polymerázou.Dva z těchto primerů mají komplementární sekvence, které rozpoznávají sekvence v ostatních primerech a vážou je, což umožňuje vytvoření „smyčkové“ struktury v nově syntetizované DNA, která pak napomáhá nasedání primeru v následujících kolech amplifikace.LAMP lze vizualizovat více metodami, včetně fluorescence, elektroforézy na agarózovém gelu nebo kolorimetrie.Snadná vizualizace a detekce přítomnosti nebo nepřítomnosti produktu kolorimetrií a nedostatek potřebného drahého vybavení učinily LAMP vhodnou volbou pro testování SARS-CoV-2 v oblastech, kde nebylo snadno dostupné klinické laboratorní testování, nebo pro skladování a přepravu vzorků. nebylo možné, nebo v laboratořích, které dříve neměly zařízení pro termocyklování PCR.