Tradiční reverzní transkriptázy nemohou tolerovat vysoké teploty (optimální teplota pro aktivitu MMLV je 37-50 °C a AMV je 42-60 °C).Složitější virovou RNA nelze účinně reverzně transkribovat do cDNA při nízkých teplotách, což vede k účinnosti detekce snížení.Tradiční RT-qPCR obecně vyžaduje účast dvou klíčových enzymů (reverzní transkriptázy a DNA polymerázy), což znemožňuje zjednodušit provoz reakčního systému a snížit náklady.Zde představíme dvě reverzní transkriptázy odolné vůči vysokým teplotám, TtH a RevTaq.Tyto dva enzymy mají také funkci DNA polymerázy, proto se nazývají bifunkční enzymy.

TtH DNA polymeráza

Určitě jste slyšeli o TtH, který je odvozen od termofilní bakterie Thermus thermophilus HB8.V přítomnosti dvojmocných kationtů, jako je Mg2+, má DNA polymerázovou aktivitu.Je široce používán v PCR reakcích jako enzym Taq, ale má vyšší tepelnou odolnost než enzym Taq, takže má také lepší účinek na PCR s vysokým obsahem templátů GC.

· Tento enzym v podstatě nemá žádnou 3′→5′ exonukleázovou aktivitu a 5′→3′ exonukleázovou aktivitu, lze jej tedy použít i pro dideoxy sekvenování.

· Tento enzym má aktivitu RTázy.V přítomnosti Mn2+ se zvýší aktivita RTázy.Pomocí této funkce jej lze použít k provedení reverzní transkripční reakce a PCR reakce ve stejné zkumavce, tj. jednokrokové RT-PCR.Avšak v přítomnosti Mn2+ není přesnost RT-PCR vysoká.Aktivita RT nemá nic společného s aktivitou rnaázy H.

· Zvýšená aktivita Tth-DNA polymerázy (pH9, optimum +55℃～+70℃, maximum +95℃) překonává problémy způsobené sekundární strukturou RNA.Výsledná cDNA může být amplifikována pomocí PCR se stejným enzymem v přítomnosti Mg2+ iontů.

· Schopnost Tth-DNA polymerázy provádět reverzní transkripci a amplifikaci DNA při vysokých teplotách činí tento enzym užitečným pro kvantitativní RT-PCR, klonování a analýzu genové exprese buněčné a virové RNA.
· Tth-DNA polymeráza se používá pro RT-PCR k amplifikaci RNA až do 1 kb.

Vlastnosti a výhody

Tth DNA polymeráza:

• Zajistěte velikost produktu optimalizované polymerázové řetězové reakce (PCR), alespoň 1000 bp v reakci RT-PCR

• Přijměte modifikovaný deoxyribonukleosidtrifosfát jako substrát

• Nesouvisí s aktivitou RNázy H

• Má vysokou tepelnou stabilitu k překonání problémů, obvykle souvisejících s vysokou sekundární strukturou přítomnou v RNA

RevTaq RT-PCR DNA polymeráza

Tepelně odolná DNA polymeráza s aktivitou reverzní transkriptázy

RevTaq-RT-PCR-DNA polymeráza je umělý, vysoce tepelně odolný, duální funkční enzym s aktivitami reverzní transkriptázy a DNA polymerázy získanými prostřednictvím řízené a umělé evoluce.

· Poločas RevTaq RT-PCR DNA polymerázy při 95 °C je delší než 40 minut.

· RevTaq RT-PCR DNA polymeráza umožňuje vysokoteplotní reverzní transkripci přímo z RNA templátu a krok reverzní transkripce lze opakovat vícekrát, aby se vytvořilo více cDNA templátů.

· RevTaq RT-PCR DNA polymeráza umožňuje „nulový krok“ RT-PCR (žádný krok izotermické reverzní transkripce), protože v kroku cyklické extenze PCR probíhá reverzní transkripce a amplifikace DNA současně.To také podporuje reakci reverzní transkripce při vysokých teplotách, čímž se minimalizují problémy, se kterými se setkáváme při tání silné sekundární struktury v RNA při vysokých teplotách.

· Díky formuli s horkým startem na bázi aptameru bude RevTaq RT-PCR DNA polymeráza produkovat lepší výsledky, když je teplota nasedání a prodlužování vyšší než 57 °C.

· Protože je enzym tepelně odolný, doporučuje se navrhovat primery a sondy s velmi vysokými body tání (>60°C).

· Doporučuje se optimalizovat teplotu kroku žíhání/prodlužování pomocí teplotního gradientu během procesu nastavení reakce.

· Čím vyšší teplota, tím vyšší specifita PCR.Cyklus reverzní transkripce se obvykle provádí při vyšší teplotě než cyklus PCR, protože hybridizace DNA Primer:RNA Template má obvykle vyšší bod tání než duplex DNA Primer:cDNA Template.

· RevTaq RT-PCR DNA polymeráza je geneticky upravená a optimalizovaná a velikost amplikonu je mezi 60-300 bp.

RevTaq RT-PCR limit detekce DNA polymerázy dosahuje 4 kopií/

Optimalizovaný reakční systém (ustavení primerů s vysokým bodem tání) je znázorněn na obrázku.RevTaq RT-PCR RT-PCR řízená DNA polymerázou vykazuje lepší citlivost než hlavní směs TaqPath 1-step RT-qPCR a nižší detekční gradient ředění vzorku.

Další výhody:

Funkce rychlého startu → Počáteční krok tepelné denaturace lze přeskočit.

Vzorec aptameru s horkým startem → Okamžitě zajistí 100% enzymatickou aktivitu a zabrání nespecifické amplifikaci při nízkých teplotách (<57°C).

Funkce štěpení → Krok extrakce RNA je vynechán, protože RevTaq RT-PCR DNA polymeráza může také zpracovat surové reakční vzorky.Dokáže okamžitě zničit buněčné membrány eukaryot, bakterií a virů v horkém cyklu RT-PCR.

Úroveň surovin IVD → vysoké standardy kvality a extrémně konkurenceschopné ceny