Nedávno jsem objevil něco úžasného!Mnoho pokročilých experimentálních profesionálů kolem něj ani nezná některé velmi základní experimentální vědomosti.

Dokážete odpovědět například na následující otázky?

Je rozdíl mezi OD260 a A260?Co každý znamená?
OD je zkratka optické hustoty (optická hustota), A je zkratka absorbance (absorbance), oba pojmy jsou vlastně stejné, „optická hustota“ je „absorbance“, ale „optická hustota“ je v souladu s většinou národních norem a je standardizovanější.

Obvykle měříme hodnotu OD při 260nm, abychom vypočítali koncentraci nukleové kyseliny, takže co představuje 1OD?
Nukleová kyselina má maximální absorpční pík při vlnové délce 260nm, která obsahuje jak DNA, tak RNA, stejně jako fragmentované fragmenty nukleové kyseliny (toto je klíčový bod).
Hodnota OD naměřená při vlnové délce 260 nm byla zaznamenána jako OD260.Pokud je vzorek čistý, může hodnota OD260 vypočítat koncentraci vzorku nukleové kyseliny.
1 OD260=50 μg/ml dsDNA (dvouvláknová DNA)
=37 μg/ml ssDNA (jednovláknová DNA)
=40 ug/ml RNA
=30 μg/ml dNTP (oligonukleotidů)
Existuje nějaké spojení a rozdíl mezi RT-PCR, Realtime-PCR a QPCR?
RT-PCR je zkratka pro Reverse Transscription PCR
Real Time PCR=qPCR, zkratka pro Quantitative Real Time PCR
Ačkoli se zdá, že Real Time PCR (real-time fluorescenční kvantitativní PCR) a reverzní transkripční PCR (reverzní transkripční PCR) jsou zkráceny jako RT-PCR.Ale mezinárodní konvence zní: RT-PCR konkrétně odkazuje na PCR s reverzní transkripcí.

Jaké jsou běžně používané nt, bp a kb k popisu délky DNA/RNA v biologii?
nt = nukleotid
bp = pár bází pár bází
kb = kilobáze

Samozřejmě byste řekli, že mnoho lidí o tyto malé detaily nestojí!Dělá to každý a nikdo se vás nebude ptát, co to je.Víš, že je to zbytečné, že?

Ne, ne, ne, to je velmi nutné vědět!kvůli čemu?
Protože chcete zveřejnit článek!Bratr!Ať už usilujete o promoci nebo usilujete o úspěchy ve vědeckém výzkumu, musíte se spolehnout na to, že budete mluvit!

Extrakce nukleových kyselin by měla být nejjednodušší a nejzákladnější experiment.Kvalita extrakce nukleové kyseliny přímo určuje výsledky následných experimentů.

I když jsem to řekl mnohokrát, stále je mnoho přátel, kterým je to jedno.Tentokrát jsem se rozhodl z článku odejít!

Minimální informace pro zveřejnění kvantitativních experimentů PCR v reálném čase, označovaných jako MIQE, je soubor mezinárodně zavedených pokynů pro fluorescenční kvantitativní experimenty, které navrhují minimální standardy pro experimentální informace nezbytné pro hodnocení fluorescenčních kvantitativních PCR experimentů a publikování článků.Prostřednictvím experimentálních podmínek a metod analýzy poskytnutých experimentátorem mohou recenzenti lépe vyhodnotit platnost výzkumného experimentálního schématu.

Je vidět, že v sekci extrakce nukleových kyselin byly navrženy následující položky detekce:

„E“ označuje informace, které musí být poskytnuty, a „D“ označuje informace, které by měly být poskytnuty v případě potřeby.

Forma je velmi složitá, vlastně chci říct, že každý musí začít od

čistota (D), výtěžek (D), integrita (E) a konzistence (E) pro hodnocení nukleových kyselin v těchto čtyřech aspektech.

Podle experimentálních zvyklostí si nejprve promluvte o metodách hodnocení čistoty a koncentrace.

Měření OD je oblíbenou a nejjednodušší metodou detekce pro experimentátory.Co se týče principu, nebudu se zde rozepisovat.Mnoho laboratoří nyní používá ultramikro spektrofotometry k přímé kvantitativní analýze vzorků nukleových kyselin.Při zobrazení hodnoty absorbance program přímo udává hodnotu koncentrace (nukleová kyselina, protein a fluorescenční barvivo) a související poměry.Pokud jde o analýzu hodnoty OD, uložte tento obrázek a budete v pořádku.

Univerzální seznam řešení hodnoty OD

Existuje však několik upozornění, která je pro vás třeba uvést samostatně.

(Koneckonců vím, že vy musíte být ti, kdo šetří a čekají, až je budete potřebovat!)

Poznámka 1 Vybavení

Hodnota OD bude ovlivněna různým vybavením.Dokud je OD260 v určitém rozsahu, mají hodnoty OD230 a OD280 smysl.Například rozsah absorbance běžného Eppendorf D30 při 260 nm je 0~3A a NanoDrop One od Thermo je při 260nm.Rozsah absorbance 0,5~62,5A.

Poznámka 2Ředicí činidlo

Hodnota OD může být ovlivněna ředěním různých činidel.Například čtení OD260/280 purifikované RNA v pH7,5 10 mM Trisbuffer je mezi 1,9-2,1, zatímco inneutrální vodný roztokpoměr bude nižší, možná jen 1,8-2,0, ale to neznamená, že se kvalita RNA mění Rozdíl.

Poznámka 3Zbytkové látky

Existence reziduálních látek ovlivní přesnost měření koncentrace nukleových kyselin, proto je nutné se ve vzorcích nukleových kyselin co nejvíce vyhýbat zbytkům proteinů, fenolů, polysacharidů a polyfenolů.

Ve skutečnosti je však extrakce organickými činidly stará metoda.V komerčních soupravách lze extrakčního efektu dosáhnout pomocí adsorpční kolony na bázi oxidu křemičitého v kombinaci s centrifugací, čímž se vyhneme toxickým a škodlivým organickým činidlům, která se obtížně odstraňují atd. Problém, jako je např.Sada pro extrakci nukleových kyselin Foregene, nepoužívá DNázu/RNázu a toxická organická činidla během operace, rychlá a bezpečná, aefekt jedobrý(náhodou řekl, že to byl plešatý, ale vím, že to chceš vědět).

Příklad 1: Výtěžek a čistota extrakce genomové DNA

Foregene Soil DNA Isolation Kit (DE-05511) zpracovává vzorky půdy z různých zdrojů a množství a čistota získané genomové DNA jsou uvedeny v následující tabulce:
Příklad 2: Výtěžek a čistota extrakce tkáňové RNA

Animal Total RNA Isolation Kit (RE-03012) zpracoval různé vzorky tkání a množství a čistota získané RNA jsou uvedeny v tabulce níže (pro myší tkáň):
Nemyslete si však, že jste s hodnotou OD skončili.Máte nějakou péči o klíčové body, které jsem vám nakreslil vpředu?

Oznámení

V absorbanci budou také vypočítány fragmentované molekuly nukleové kyseliny.Za předpokladu, že máte v RNA zbytky genomové DNA, bude se vaše hodnota OD jevit jako velmi vysoká, ale skutečnou koncentraci RNA nelze určit.Zda je vaše RNA Není jasné, zda dochází k degradaci, takže stále potřebujeme komplexní metodu hodnocení, abychom poskytli přesnější úsudek, tj. hodnocení integrity nukleové kyseliny zmíněné v MIQE.