RT-qPCR je vyvinuta z běžné PCR technologie.Přidává fluorescenční chemikálie (fluorescenční barviva nebo fluorescenční sondy) do tradičního reakčního systému PCR a detekuje proces žíhání a prodlužování PCR v reálném čase podle jejich různých luminiscenčních mechanismů.Změny fluorescenčního signálu v médiu se používají k výpočtu množství změny produktu v každém cyklu PCR.V současnosti jsou nejběžnějšími metodami fluorescenční barvivová metoda a sondová metoda.

Metoda fluorescenčního barviva:
Některá fluorescenční barviva, jako je SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO atd., sama o sobě světlo nevyzařují, ale po navázání na menší žlábek dsDNA emitují fluorescenci.Na začátku PCR reakce tedy přístroj nemůže detekovat fluorescenční signál.Když reakce postoupí do fáze annealing-extension (dvoukroková metoda) nebo fáze extenze (tříkroková metoda), dvojřetězce se v tomto okamžiku otevřou a nová DNA polymeráza Během syntézy vlákna se fluorescenční molekuly spojí v malé drážce dsDNA a emitují fluorescenci.Jak se počet cyklů PCR zvyšuje, stále více barviv se kombinuje s dsDNA a fluorescenční signál se také neustále zvyšuje.Vezměte si jako příklad SYBR Green Ⅰ.
Metoda sondy:
Taqmanova sonda je nejběžněji používanou hydrolyzační sondou.Na 5′ konci sondy je fluorescenční skupina, obvykle FAM.Sonda samotná je sekvence komplementární k cílovému genu.Na 3′ konci fluoroforu je fluorescenční zhášecí skupina.Podle principu přenosu fluorescenční rezonanční energie (Försterův rezonanční přenos energie, FRET), kdy reportérová fluorescenční skupina (donorová fluorescenční molekula) a zhášecí fluorescenční skupina (akceptorová fluorescenční molekula) Když se excitační spektrum překrývá a vzdálenost je velmi blízko (7-10nm), může excitace donorové molekuly indukovat autofluorescenci, zatímco akceptovaná fluorescence je akceptovaná.Proto na začátku PCR reakce, když je sonda volná a neporušená v systému, reportérová fluorescenční skupina nebude emitovat fluorescenci.Při nasedání se primer a sonda navážou na templát.Během fáze extenze polymeráza nepřetržitě syntetizuje nové řetězce.DNA polymeráza má 5′-3′ exonukleázovou aktivitu.Když DNA polymeráza dosáhne sondy, hydrolyzuje sondu z templátu, oddělí reportérovou fluorescenční skupinu od zhášecí fluorescenční skupiny a uvolní fluorescenční signál.Protože mezi sondou a templátem existuje vztah jedna ku jedné, metoda sondy je lepší než metoda barviva, pokud jde o přesnost a citlivost testu.

Obr. 1 Princip qRT-PCR

Návrh základního nátěru
Zásady:

Primery by měly být navrženy v konzervované oblasti série nukleových kyselin a měly by mít specificitu.

Nejlepší je použít sekvenci cDNA a přijatelná je také sekvence mRNA.Pokud ne, zjistěte design cds oblasti sekvence DNA.
Délka fluorescenčního kvantitativního produktu je 80-150 bp, nejdelší je 300 bp, délka primeru je obecně mezi 17-25 bázemi a rozdíl mezi upstream a downstream primery by neměl být příliš velký.

Obsah G+C je mezi 40% a 60% a 45-55% je nejlepší.
Hodnota TM je mezi 58-62 stupni.
Snažte se vyhnout primerovým dimerům a autodimerům, (neobjevují se více než 4 páry po sobě jdoucích komplementárních bází) vlásenková struktura, pokud je to nevyhnutelné, udělejte ΔG<4,5kJ/mol* Pokud nemůžete zajistit, že gDNA byla odstraněna během reverzní transkripce Clean, je nejlepší navrhnout primery intronu *3′ a GC, kontinuální oblasti bohaté na konec nelze modifikovat, GC AT nelze modifikovat -3) primery a ne
specifická Homologie heterogenně amplifikované sekvence je výhodně menší než 70 % nebo má homologii s 8 komplementárními bázemi.
Databáze:
CottonFGD vyhledávání podle klíčových slov
Návrh základního nátěru:
Návrh primeru IDT-qPCR

Obr.2 Stránka online nástroje pro návrh primerů IDT

Obr3 zobrazení stránky s výsledky
Návrh primerů lncRNA:
lncRNA:stejné kroky jako mRNA.
miRNA:Princip metody stem-loop: Vzhledem k tomu, že všechny miRNA jsou krátké sekvence o délce asi 23 nt, nelze provést přímou PCR detekci, proto je použit nástroj sekvence stem-loop.Sekvence vlásenky je jednovláknová DNA o délce asi 50 nt, která sama o sobě může tvořit vlásenkovou strukturu.3 'Konec může být navržen jako sekvence komplementární k částečnému fragmentu miRNA, poté může být cílová miRNA připojena k sekvenci stem-loop během reverzní transkripce a celková délka může dosáhnout 70 bp, což je v souladu s délkou amplifikovaného produktu určeného pomocí qPCR.Návrh primeru Tailing miRNA.
Detekce specifická pro amplifikaci:
Online databáze blastů: CottonFGD blast podle podobnosti sekvence
Local blast: Viz použití Blast+ k provádění lokálních výbuchů, linux a macos mohou přímo vytvořit místní databázi, systém win10 lze také provést po instalaci ubuntu bash.Vytvořte místní databázi odstřelu a místní odpal;otevřete ubuntu bash na win10.
Upozornění: Bavlna z horských oblastí a bavlna z mořských ostrovů jsou tetraploidní plodiny, takže výsledkem výbuchu budou často dvě nebo více shod.V minulosti použití NAU cds jako databáze pro provádění blastu pravděpodobně nalezlo dva homologní geny s pouze několika SNP rozdíly.Obvykle nelze tyto dva homologní geny oddělit návrhem primeru, takže se s nimi zachází jako se stejnými.Pokud existuje zřejmý indel, roznětka je obvykle navržena na indelu, ale to může vést k sekundární struktuře roznětky. Volná energie se zvýší, což vede ke snížení účinnosti zesílení, ale to je nevyhnutelné.

Detekce sekundární struktury primeru:
kroky:otevřít oligo 7 → zadat sekvenci templátu → zavřete podokno → uložit → najděte primer na templátu, stiskněte ctrl+D pro nastavení délky primeru → analyzujte různé sekundární struktury, jako je samodimerizační tělo, heterodimer, vlásenka, neshoda atd. Poslední dva obrázky na obrázku 4 jsou výsledky testu primerů.Výsledek předního primeru je dobrý, není zde žádná zřejmá dimerní a vlásenková struktura, žádné spojité komplementární báze a absolutní hodnota volné energie je menší než 4,5, zatímco zadní primer vykazuje spojitost. 6 bází je komplementárních a volná energie je 8,8;navíc se na 3′ konci objeví vážnější dimer a objeví se dimer 4 po sobě jdoucích bází.Ačkoli volná energie není vysoká, 3' dimer Chl může vážně ovlivnit amplifikační specificitu a účinnost amplifikace.Kromě toho je nutné zkontrolovat vlásenky, heterodimery a neshody.

Výsledky detekce obr. 3 oligo7
Detekce účinnosti zesílení:
Účinnost amplifikace PCR reakce vážně ovlivňuje výsledky PCR.Také v qRT-PCR je účinnost amplifikace zvláště důležitá pro kvantitativní výsledky.Odstraňte další látky, stroje a protokoly v reakčním pufru.Kvalita primerů má také velký vliv na účinnost amplifikace qRT-PCR.Aby byla zajištěna přesnost výsledků, jak kvantifikace relativní fluorescence, tak kvantifikace absolutní fluorescence musí detekovat účinnost amplifikace primerů.Uznává se, že efektivní účinnost amplifikace qRT-PCR je mezi 85 % a 115 %.Existují dva způsoby:
1. Metoda standardní křivky:
A.Smíchejte cDNA
b.Gradientové ředění
c.qPCR
d.Lineární regresní rovnice pro výpočet účinnosti amplifikace
2. LinRegPCR
LinRegPCR je program pro analýzu dat RT-PCR v reálném čase, nazývaných také data kvantitativní PCR (qPCR) založená na SYBR Green nebo podobné chemii.Program používá neopravená data, provádí korekci základní linie u každého vzorku samostatně, určuje okno linearity a poté používá lineární regresní analýzu k proložení přímky přes sadu dat PCR.Ze směrnice této linie se vypočítá účinnost PCR každého jednotlivého vzorku.Průměrná účinnost PCR na amplikon a hodnota Ct na vzorek se používají k výpočtu výchozí koncentrace na vzorek, vyjádřené v libovolných fluorescenčních jednotkách.Vstup a výstup dat probíhá prostřednictvím tabulky Excel.Pouze vzorek
je nutné míchání, žádný gradient
jsou vyžadovány kroky:(Vezměte si jako příklad Bole CFX96, ne úplně stroj s jasným ABI)
experiment:je to standardní qPCR experiment.
Výstup dat qPCR:LinRegPCR dokáže rozpoznat dvě formy výstupních souborů: RDML nebo kvantifikaci Výsledek amplifikace.Ve skutečnosti je to detekční hodnota počtu cyklu a fluorescenčního signálu v reálném čase strojem a amplifikace je získána analýzou hodnoty změny fluorescence účinnosti lineárního segmentu.
Výběr dat: Teoreticky by hodnota RDML měla být použitelná.Odhaduje se, že problém mého počítače je v tom, že software nedokáže rozpoznat RDML, takže mám výstupní hodnotu excelu jako původní data.Doporučuje se nejprve provést hrubý screening dat, např. selhání přidání vzorků apod. Body lze ve výstupních datech smazat (samozřejmě je nelze smazat, LinRegPCR bude tyto body v pozdější fázi ignorovat)

Obr.5 Export dat qPCR

Obr. 6 výběr kandidátských vzorků

Vstup dat:Otevřete výsledky amplifikace kvalifikace.xls, → otevřete LinRegPCR → soubor → načtěte z excelu → vyberte parametry, jak je znázorněno na obrázku 7 → OK → klikněte na určit základní linie

Obr7 kroky vstupu dat linRegPCR

Výsledek:Pokud nedochází k opakování, není nutné seskupování.Pokud dojde k opakování, lze seskupení upravit ve vzorovém seskupení a do identifikátoru se zadá název genu a poté se automaticky seskupí stejný gen.Nakonec klikněte na soubor, exportujte excel a zobrazte výsledky.Zobrazí se účinnost amplifikace a výsledky R2 každé jamky.Za druhé, pokud rozdělíte do skupin, zobrazí se opravená průměrná účinnost zesílení.Zajistěte, aby účinnost amplifikace každého primeru byla mezi 85 % a 115 %.Pokud je příliš velký nebo příliš malý, znamená to, že účinnost amplifikace primeru je nízká.

Obr. 8 Výsledek a výstup dat

Experimentální proces:
Požadavky na kvalitu RNA:
Čistota:1.72,0 znamená, že zde může být zbytkový isothiokyanát.Čistá nukleová kyselina A260/A230 by měla být kolem 2. Pokud je silná absorpce při 230 nm, znamená to, že existují organické sloučeniny, jako jsou fenátové ionty.Navíc může být detekován elektroforézou na 1,5% agarózovém gelu.Ukažte marker, protože ssRNA nemá žádnou denaturaci a logaritmus molekulové hmotnosti nemá lineární vztah a molekulovou hmotnost nelze správně vyjádřit.Koncentrace: Teoretickyneméně než 100 ng/ul, pokud je koncentrace příliš nízká, čistota je obecně nízká ne vysoká

Obr. 9 RNA gel

Kromě toho, pokud je vzorek vzácný a koncentrace RNA je vysoká, doporučuje se jej po extrakci rozdělit na alikvoty a zředit RNA na konečnou koncentraci 100-300 ng/ul pro reverzní transkripci.vproces reverzní transkripce, když je mRNA transkribována, jsou pro reverzní transkripci použity oligo (dt) primery, které se mohou specificky vázat na polyA konce, zatímco lncRNA a circRNA používají pro reverzní transkripci celkové RNA primery náhodného hexameru (Random 6 mer) U miRNA se pro reverzní transkripci používají primery specifické pro miRNA.Mnoho společností nyní uvedlo na trh speciální sady pro odkalování.Pro metodu stem-loop je metoda tailing pohodlnější, vysoce výkonná a šetří reagencie, ale efekt rozlišení miRNA stejné rodiny by neměl být tak dobrý jako metoda stem-loop.Každá souprava pro reverzní transkripci má požadavky na koncentraci genově specifických primerů (stem-loops).Vnitřní reference použitá pro miRNA je U6.V procesu inverze stonku-smyčky by měla být trubice U6 obrácena samostatně a přední a zadní primery z U6 by měly být přidány přímo.Jak circRNA, tak lncRNA mohou používat HKG jako interní referenci.vdetekce cDNA,
pokud není problém s RNA, cDNA by měla být také v pořádku.Pokud však jde o dokonalost experimentu, je nejlepší použít interní referenční gen (referenční gen, RG), který dokáže odlišit gDNA od cds.Obecně platí, že RG je housekeeping gen.HKG), jak je znázorněno na obrázku 10;V té době jsem vyráběl zásobní protein ze sojových bobů a jako interní referenci jsem použil aktin7 obsahující introny.Velikost amplifikovaného fragmentu tohoto primeru v gDNA byla 452 bp, a pokud byla cDNA použita jako templát, byla 142 bp.Výsledky testu pak zjistily, že část cDNA byla skutečně kontaminována gDNA, a také prokázaly, že s výsledkem reverzní transkripce není problém a lze ji použít jako templát pro PCR.Je zbytečné provádět elektroforézu na agarózovém gelu přímo s cDNA a jedná se o difuzní pás, který není přesvědčivý.

Obr. 10 detekce cDNA

Stanovení podmínek qPCRnení obecně žádný problém podle protokolu kitu, hlavně v kroku hodnoty tm.Pokud některé primery nejsou dobře navrženy během návrhu primeru, což má za následek velký rozdíl mezi hodnotou tm a teoretickými 60 °C, doporučuje se, aby cDNA Po smíchání vzorků spustili gradientovou PCR s primery a snažte se vyhnout nastavení teploty bez pásů jako hodnoty TM.

Analýza dat

Konvenční metoda kvantitativního zpracování relativní fluorescence PCR je v zásadě podle 2-ΔACT.Šablona zpracování dat.

Související produkty:

Real Time PCR Easy^TM – Taqman

Real Time PCR Easy^TM – SYBR GREEN I

RT Easy I (Master Premix pro syntézu prvního vlákna cDNA)

RT Easy II (Master Premix pro syntézu prvního vlákna cDNA pro qPCR)