PCR, násobek PCR, In situ PCR, Reverzní PCR, RT-PCR, qPCR（1）–PCR

Probereme koncepty, kroky a detaily různých PCR

Ⅰ. PCR

Polymerázová řetězová reakce, označovaná jako PCR, je molekulárně biologická technologie, která se používá ke zvětšení specifických fragmentů DNA.Lze ji považovat za speciální replikaci DNA in vitro.DNA polymeráza (DNA Polymerase I) byla objevena již v roce 1955 a Klenowův fragment E. Coli, který má experimentální hodnotu a praktičnost, objevil Dr. H. Klenow na počátku 70. let, ale protože tento enzym nesnáší teplotu, vysoká teplota jej může degenerovat, takže nevyhovuje polymerázové řetězové reakci s degenerací při vysoké teplotě.Enzymy, které se dnes používají (nazývané Taq polymeráza), byly izolovány z Thermus aquaticus, bakterie z horkých pramenů v roce 1976. Jeho charakteristikou je, že odolává vysokým teplotám a je ideálním enzymem, ale široce se používá po 80. letech 20. století.Původní koncept původního primitivního prototypu PCR je podobný genové opravě a kopírování, kterou navrhl Dr. KJell Kleppe v roce 1971. Publikoval první jednoduchou a krátkodobou genovou kopii (podobnou reakcím prvních dvou cyklů PCR).Dnes vyvinutá PCR byla vyvinuta Dr. Kary B. Mullisem v roce 1983. Dr. Mullis sloužil ten rok PE společnostem, takže PE má v průmyslu PCR zvláštní postavení.Dr. Mullis oficiálně publikoval první související článek se Saiki a dalšími v roce 1985. Od té doby je použití PCR tisíce mil denně a lze říci, že kvalita souvisejících článků činí mnoho dalších výzkumných metod nechutnými.Následně je technologie PCR široce používána v biologickém vědeckém výzkumu a klinických aplikacích a stává se nejdůležitější technologií výzkumu molekulární biologie.Mullis také získal v roce 1993 Nobelovu cenu za chemii.

PCRZásada

Základní princip technologie PCR je podobný přirozenému procesu replikace DNA a její specificita závisí na oligonukleotidovém primeru, který je komplementární k oběma koncům cílové sekvence.PCR se skládá ze tří základních reakčních kroků degenerace-žíhání-prodlužování: ①Degenerace templátové DNA: Poté, co se templátová DNA po určitou dobu zahřeje na teplotu asi 93 °C, roztok duální DNA pro dvouřetězcovou DNA vytvořený PCR amplifikací odcházející templátové DNA z něj učiní jednoduchý řetězec, aby jej bylo možné zkombinovat s primerem v dalším kole a připravit se na další kolo reakce.②Annealing (sloučenina) templátové DNA a primeru: Poté, co je templátová DNA zahřátá a degenerována do jednoho řetězce, teplota klesne na přibližně 55 °C.Komplementární sekvence jednořetězcového primeru a templátové DNA.③Prodloužení primeru: templát DNA – vazba primeru je založena na působení TaqDNA polymerázy, s dNTP jako reakční surovinou.Zachovejte princip replikace, syntetizujte nový semi-rezervovaný kopírovací řetězec, který doplňuje templátový řetězec DNA, a opakujte cyklus degenerace-žíhání-prodlužování tři procesy mohou získat více „polorezervovaného kopírovacího řetězce“ a tento nový řetězec je opět dostupný Staňte se templátem pro další cyklus.Dokončení smyčky trvá 2-4 minuty, cílový gen může být amplifikován několik milionůkrát za 2-3 hodiny.

StandardPCRReakční systém

Pět prvků PCR reakce

Na PCR reakci se podílí hlavně pět druhů látek, jmenovitě primer, enzym, dNTP, templát a pufr (vyžaduje se Mg2+).[postup PCR]

Standardní proces PCR je rozdělen do tří kroků

1. Degenerace DNA (90°C-96°C): Dvouřetězcové DNA templáty pod tepelným působením se přeruší vodíkové vazby a vytvoří se jednořetězcová DNA.

2. Žíhání (25℃ -65℃): Teplota systému je snížena, primer je kombinován s DNA templátem za vzniku lokálního dvouřetězcového řetězce.

3. Extenze (70℃ -75℃): Působením enzymu Taq (asi 72°C, nejlepší aktivita) se jako surovina používá dNTP, rozprostírá se od 5′ konce primeru → 3′ konce, syntéza a templát se navzájem doplňují řetězce DNA.

Každý cyklus je denaturován, žíhán a prodloužen, čímž se zdvojnásobuje obsah DNA.V současné době lze díky krátké amplifikační oblasti některé PCR replikovat ve velmi krátkém čase, i když aktivita enzymu Taq není optimální, lze ji tedy změnit na dva kroky, to znamená, že nasedání a extenze lze provádět při 60°C-65°C současně.Za účelem snížení procesu zvedání a chlazení a zlepšení rychlosti odezvy.

Vlastnosti PCR reakce

● Vysoká specifičnost

Specifické rozhodující faktory reakce PCR jsou: ①Specifická kombinace primeru a templátové DNA.②Princip párování bází.③Věrnost reakce syntézy polymerázy TaqDNA.④Specificita a konzervativnost cílového genu.

Klíčem je správná kombinace primerů a šablon.Vazba primeru a templátu a prodloužení řetězce primeru jsou založeny na principu párování alkalických bází.Loajalita reakcí polymerázové syntézy a vysoká teplotní odolnost Taq DNA polymerázy k vytvoření vazby (sloučeniny) templátu a primeru v reakci lze provádět při vyšší teplotě.Specifičnost kombinace je značně zvýšena.Klip si může zachovat vysoký stupeň správnosti.Výběrem cílové genetické oblasti s vysokou konzervativností a vysokou konzervativností je její specificita vyšší.

● Vysoká citlivost

Objem produkce PCR produktů se zvyšuje o index, který může rozšířit výchozí templát Pickeru (PG=10-12) pro zvýšení úrovně mikrokontroléru na úroveň mikrogramů (μg= -6).Cílové buňky mohou být detekovány z 1 milionu buněk;při detekci virů může senzitivita PCR dosáhnout 3 RFU (prázdná místa tvoří jednotky);minimální míra detekce v bakteriální vědě je 3 bakterie.

● Jednoduché a rychlé

Reflexe PCR využívá vysokoteplotní Taq DNA polymerázu, která přidává reakční roztok najednou, tj. degeneraci-žíhání-extenzní reakci na amplifikační roztok DNA a nádobu s vodní lázní.Obecně je amplifikační reakce dokončena za 2 až 4 hodiny.Rozšířené produkty jsou obecně analyzovány elektrickým mečem a nemusí používat izotopy, žádné radioaktivní znečištění a snadnou propagaci.

● Čistota vzorku je nízká

Není potřeba oddělovat viry nebo bakterie a kultivovat buňky.Surové produkty DNA a RNA mohou být použity jako zesilovače.Detekce amplifikace DNA může být použita přímo s použitím klinických vzorků, jako je krev, tělesná tekutina, tekutina na vymývání kašle, vlasy, buňky a živá tkáň.

PCRběžné problémy

● Falešně negativní, žádné zesílené pásy

Mezi klíčové fáze PCR reakce patří: ① příprava templátových nukleových kyselin, ② kvalita a specificita primerů, ③ kvalita enzymů ④ podmínky cyklu PCR.Nalezení důvodu by mělo být také analyzováno a prostudováno pro výše uvedené odkazy.

Šablony: ① Šablona obsahuje různé proteiny, ② Šablona obsahuje inhibitor enzymu Taq, ③ Protein v templátu není eliminován, zejména skupinový protein v chromozomu.⑤ Deminerace nukleové kyseliny není důkladná.Když je kvalita enzymů a primerů dobrá, neexistuje žádný amplifikační pás, což je s největší pravděpodobností trávicí léčba vzorků.S procesem extrakce templátové nukleové kyseliny není něco v pořádku, takže pro přípravu účinného a stabilního štěpícího roztoku by měl být jeho postup pevně stanoven a ne libovolně měněn.

Inaktivace enzymu: nový enzym nebo staré i nové enzymy by měly být použity společně k analýze, zda je aktivita enzymu ztracena nebo nedostatečná, což vede k falešně negativním výsledkům.Je třeba poznamenat, že se někdy zapomíná na enzym Taq nebo ethidium bromid.

Primer: kvalita primeru, koncentrace primeru a zda je koncentrace obou primerů symetrická.Je častým důvodem selhání PCR nebo zvětšující se pás není ideální a náchylný k difuzi.U některých čísel šarží jsou problémy s kvalitou primerů.Tyto dva primery mají vysokou koncentraci a nízkou koncentraci, což způsobuje asymetrickou amplifikaci s nízkou účinností.Protiopatření jsou: ① Vyberte dobrý primer pro syntézu jednotek.② Koncentrace primeru nezávisí pouze na hodnotě OD, ale také věnuje pozornost původní kapalině primeru, aby se provedla elektroforéza na agarovém cukrovém gelu.Musí existovat zóna základního proužku a jas obou základních nátěrů by měl být obecně konzistentní.Belt, PCR může v tuto chvíli selhat a mělo by to být vyřešeno pomocí jednotky pro syntézu primeru.Pokud je základní nátěr vysoký, jas je nízký a jeho koncentrace musí být po zředění vyrovnaná.③ Základní nátěr by měl být zaplacen a skladován ve vysoké koncentraci, aby se zabránilo vícenásobnému zmrazení nebo dlouhodobému chlazení částí chladničky, které způsobí znehodnocení a degradaci základního nátěru.④ Návrh primeru je nepřiměřený, protože délka primeru je nedostatečná a mezi primery se tvoří di shluk.

Koncentrace Mg2+: Koncentrace Mg2+iontů má velký vliv na účinnost amplifikace PCR.Nadměrná koncentrace může snížit opačné pohlaví amplifikace PCR.Pokud je koncentrace příliš nízká, výstup PCR amplifikace dokonce způsobí selhání amplifikace PCR bez expanzního pásma.

Změna reakčního objemu: Objem použitý při PCR amplifikaci je 20 ul, 30 ul a 50 ul nebo 100 ul, velký objem aplikace pro PCR amplifikaci je nastaven podle různých účelů vědeckého výzkumu a klinického testování.Po výrobě malých objemů např. 20ul je nutné při výrobě velikosti udělat podmínku šňůry, jinak selže.

Fyzikální důvody: Transformace je pro PCR amplifikaci velmi důležitá.Pokud je teplota degenerace nízká, doba degenerace je krátká, pravděpodobně k ní dojde u falešně negativních výsledků;příliš nízká teplota žíhání může způsobit nespecifickou amplifikaci a snížit specifickou účinnost amplifikace.Vysoce ovlivní kombinaci primerů a templátů pro snížení účinnosti amplifikace PCR.Někdy je nutné použít standardní teploměry ke zjištění variability, žíhání a prodloužené teploty v nástavném nebo vodorozpustném vařáku, což je jeden z důvodů neúspěchu PCR.

Varianty cílové sekvence: Pokud dojde k cílové sekvenci, dojde k mutaci nebo deleci, zkombinuje se kombinace prototypu a templátu nebo v důsledku chybějící cílové sekvence primer a templát ztratí komplementární sekvenci a její PCR amplifikace nebude úspěšná.

● Falešně pozitivní

Pás amplifikace PCR se zdá být konzistentní s pásem cílové sekvence a někdy je jeho pás čistější a vyšší.

Návrh primeru není vhodný: vybraná amplifikační sekvence a neúčelová amplifikační sekvence jsou homologní, takže při PCR amplifikaci jsou amplifikované PCR produkty neúčelové sekvence.Cílová sekvence je příliš krátká nebo primer je příliš krátký a je náchylný k falešně pozitivním výsledkům.Nutno předělat.

Křížové znečištění cílové sekvence nebo amplifikačních produktů: Existují dva důvody pro toto znečištění: Za prvé, křížové znečištění celého genomu nebo velkých segmentů, což vede k falešným pozitivům.Tento druh falešně pozitivních výsledků lze vyřešit následujícími metodami: Buďte opatrní a opatrní během provozu, abyste zabránili vdechnutí cílové sekvence do vzorkovací pistole nebo vystříknutí z odstředivé zkumavky.Kromě enzymů a látek, které nesnesou vysoké teploty, by měla být všechna činidla nebo zařízení dezinfikována vysokým tlakem.Odstředivé trubky a vzorky by měly být použity najednou.V případě potřeby se před přidáním vzorků reakční zkumavka a činidlo vystaví ultrafialovému záření, aby se zničila existující nukleová kyselina.Za druhé, malé úlomky ve znečištění ovzduší.Tyto malé fragmenty jsou kratší než cílová sekvence, ale mají určitou homologii.Dá se vzájemně spojovat.Po doplnění primerů může být produkt PCR expandován, což způsobí falešně pozitivní produkci.Lze jej použít ke snížení nebo odstranění metody nest PCR.

● Zobrazí se nespecifické pásmo zesílení

Pásy, které se objevily po PCR amplifikaci, jsou nekonzistentní s očekávanou velikostí, nebo jsou velké nebo malé, nebo současně, nebo ve stejnou dobu, specifické amplifikační pásy a nespecifické amplifikační pásy.Vznik nespecifických pásů je: Za prvé, primery jsou neúplné komplementární k cílové sekvenci nebo polymeraci primeru za vzniku diklastru.Druhým je, že koncentrace MG2+iontů je příliš vysoká, teplota žíhání je příliš nízká a s tím souvisí počet cyklů PCR.Za druhé kvalita a množství enzymů.Často jsou enzymy některých zdrojů náchylné k nespeciálním pásům a enzymy z jiného zdroje se nevyskytují.Někdy dochází i k nespecifické amplifikaci enzymů.Protiopatření jsou: v případě potřeby předělat atraktivity.Snižte množství enzymu nebo nahraďte enzym z jiného zdroje.Snižte množství primárních, přiměřeně zvyšte množství šablon a snižte počet cyklů.Správně zvyšte teplotu žíhání nebo použijte metodu dvou teplotních bodů (93°C degenerace, žíhání a prodlužování při cca 65°C).

● Zdá se, že se koudel loupe nebo rozmazává páska

Někdy se zdá, že PCR amplifikace je aplikována nebo skořápka nebo pás podobný koberci.Z toho důvodu, kvůli nadměrnému množství enzymů nebo špatné kvalitě enzymu, je koncentrace dNTP příliš vysoká, koncentrace Mg2+ příliš vysoká, teplota žíhání je příliš nízká a počet cyklů je příliš velký.Protiopatření jsou: ①Snižte množství enzymů nebo změňte enzym z jiného zdroje.②Snižte koncentraci dNTP ③Řádně snižte koncentraci Mg2+.④Zvyšte množství šablon a snižte počet cyklů.

Související produkty

PCR Heroᵀᴹ (s barvivem)

◮ Vyšší věrnost: 6krát vyšší než u běžného enzymu Taq;

◮ Vyšší rychlost zesílení

◮ Větší přizpůsobivost šablony

◮ Vyšší účinnost zesílení

◮ Tolerance prostředí je silnější: umístěte na 37 °C po dobu jednoho týdne, udržujte více než 90% aktivitu;

◮ Má 5'→3' DNA polymerázovou aktivitu a 5'→3' exonukleázovou aktivitu, bez 3'→5' exonukleázové aktivity.

PCR Easyᵀᴹ (s barvivem)

Unikátní reakční systém a vysoce účinná Taq DNA polymeráza zajišťují, že PCR reakce má vyšší účinnost amplifikace, specificitu a citlivost.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (One Step)-SYBR Green I

◮ Jednokroková sada umožňuje reverzní transkripci a qPCR dvě reakce ve stejné zkumavce, pouze je třeba přidat templátovou RNA, specifické PCR primery a ddH bez RNázy₂O.

◮ Souprava může rychle a efektivně kvantitativně analyzovat virovou RNA nebo stopovou RNA.

◮ Souprava využívá unikátní reverzní transkripční činidlo Foregene a Foregene HotStar Taq DNA polymerázu v kombinaci s unikátním reakčním systémem pro účinné zlepšení účinnosti amplifikace a specifičnosti reakce.

◮ Díky optimalizovanému reakčnímu systému má reakce vyšší citlivost detekce, silnější tepelnou stabilitu a lepší toleranci.

◮ Snadná RT-qPCR^TM(One Step)-SYBR Green I kit je dodáván s ROX interním referenčním barvivem, které lze použít k odstranění signálního pozadí a chyb signálu mezi jamkami, což je pro zákazníky výhodné pro použití v různých modelech kvantitativních PCR přístrojů.

RT snadné^TMII (Master Premix pro syntéza prvního vlákna cDNA proPCR v reálném čase)

-Efektivní schopnost odstranit gDNA, která dokáže odstranit gDNA v šabloně během 2 minut.

-Efektivní systém reverzní transkripce, dokončení syntézy prvního vlákna cDNA trvá pouze 15 minut.

-Komplexní šablony: šablony s vysokým obsahem GC a složitou sekundární strukturou lze také obrátit s vysokou účinností.

-Vysoce citlivý systém reverzní transkripce, šablony na úrovni pg mohou také získat vysoce kvalitní cDNA.

-Reverzní transkripční systém má vysokou tepelnou stabilitu, optimální reakční teplota je 42 ℃ a stále má dobrý reverzní transkripční výkon při 50 ℃.