PCR je nejrozšířenější technologií amplifikace nukleové kyseliny a je široce používána díky své citlivosti a specifičnosti.PCR však vyžaduje opakovanou tepelnou denaturaci a nemůže se zbavit omezení spoléhání se na nástroje a vybavení, což omezuje její použití v klinickém testování v terénu.

Od počátku 90. let minulého století začalo mnoho laboratoří vyvíjet technologii zesílení konstantní teploty, která nevyžaduje tepelnou denaturaci.Nyní vyvinuli technologii izotermické amplifikace zprostředkované smyčkou, technologii izotermické amplifikace s náhradou vlákna, technologii izotermické amplifikace s rotujícím kruhem a závislost na sekvenci nukleové kyseliny.Technologie izotermického zesílení a další technologie. 

Lizotermické zesílení zprostředkované oop

Princip amplifikace je založen na skutečnosti, že DNA je v dynamickém rovnovážném stavu při teplotě asi 65 °C.Když je kterýkoli primer spárován a prodloužen do komplementární části dvouřetězcové DNA, druhý řetězec se disociuje a stane se jednořetězcovým.

Při této teplotě DNA používá 4 specifické primery, které se spoléhají na DNA polymerázu s vytěsňováním řetězce, aby syntéza DNA s vytěsňováním řetězce nepřetržitě cirkulovala.

Nejprve určete 6 specifických oblastí F3, F2, F1, B1, B2, B3 na cílovém genu a poté navrhněte 4 primery založené na těchto 6 specifických oblastech (jak je znázorněno na obrázku níže):

Dopředný vnitřní primer (FIP) se skládá z F1c a F2.

Zadní vnitřní primer (BIP) se skládá z B1c a B2 a TTTT je použit jako spacer uprostřed.

Vnější primery F3 a B3 jsou složeny z oblastí F3 a B3 na cílovém genu.

V reakčním systému LAMP je koncentrace vnitřního primeru několikrát vyšší než koncentrace vnějšího primeru.Vnitřní primer se nejprve zkombinuje s templátovým řetězcem, aby se syntetizovalo komplementární vlákno za vzniku dvouřetězce DNA.Následně je vnější primer kombinován s templátovým řetězcem za vzniku dvouřetězce DNA.Působením BstDNA polymerázy se uvolní komplementární vlákno syntetizované vnitřním primerem.Po sérii reakcí komplementární řetězec nakonec vytvoří jediný řetězec DNA s činkovou strukturou.

Samotný jednovláknový řetězec DNA s činkovou strukturou se používá jako templát pro kontinuální vytváření přechodné struktury DNA s kmenovou smyčkou s otevřeným koncem.Vnitřní a vnější primery vedou přechodnou strukturu vlásenky se smyčkou DNA tak, aby nepřetržitě podléhala reakcím přemístění a prodlužování řetězce a nakonec vytvořila mnohočetné struktury vlásenky se smyčkou s různými délkami.Směs DNA.

Výhody a nevýhody izotermického zesílení zprostředkovaného smyčkou

Výhody LAMP:

(1) Vysoká účinnost amplifikace, která může účinně amplifikovat 1-10 kopií cílového genu během 1 hodiny, a účinnost amplifikace je 10-100krát vyšší než u běžné PCR.

(2) Reakční doba je krátká, specifičnost je silná a není potřeba žádné speciální vybavení.

Nedostatky LAMP:

(1) Požadavky na zápalky jsou obzvláště vysoké.

(2) Amplifikovaný produkt nelze použít pro klonování a sekvenování, ale lze jej použít pouze pro posouzení.

(3) Díky své vysoké citlivosti je snadné vytvářet aerosoly, které způsobují falešné pozitivní výsledky a ovlivňují výsledky testu.

Szesílení posunu trandu

Strand displacement amplification (SDA) je in vitro izotermická technika amplifikace DNA založená na enzymatické reakci, kterou poprvé navrhl americký vědec Walker v roce 1992.

Základní systém SDA zahrnuje restrikční endonukleázu, DNA polymerázu s aktivitou vytěsňování řetězce, dva páry primerů, dNTP a ionty vápníku a hořčíku a pufrové systémy.

Princip amplifikace vytěsněním řetězce je založen na chemicky modifikované rozpoznávací sekvenci restrikční endonukleázy na obou koncích cílové DNA.Endonukleáza otevře mezeru ve řetězci DNA v jeho rozpoznávacím místě a DNA polymeráza prodlouží mezeru na 3' konci a nahradí další řetězec DNA.

Nahrazené jednoduché řetězce DNA mohou být kombinovány s primery a prodlouženy do dvou řetězců pomocí DNA polymerázy.Tento proces se nepřetržitě opakuje, takže cílová sekvence je účinně amplifikována.

Výhody a nevýhody technologie amplifikace posunu vlákna

Výhody SDA:

Účinnost zesílení je vysoká, reakční doba je krátká, specifičnost je silná a není potřeba žádné speciální vybavení.

Nevýhody SDA:

Produkty nejsou jednotné a některé jednovláknové a dvouvláknové produkty jsou vždy produkovány v cyklu SDA a při detekci elektroforézou nevyhnutelně dojde k ochlazení.

Rzesílení ollingového kruhu

Amplifikace rotujícího kruhu (RCA) je navržena na základě metody kopírování DNA z patogenních organismů pomocí rotujícího kruhu.Týká se to použití jednovláknové kruhové DNA jako templátu při konstantní teplotě a speciální DNA polymerázy (jako je Phi29) ) Pod působením syntézy DNA s rotujícím kruhem k dosažení amplifikace cílového genu.

RCA lze rozdělit na lineární a exponenciální amplifikace.Účinnost lineárního RCA může dosáhnout 10⁵krát a účinnost exponenciálního RCA může dosáhnout 10⁹časy.

Jednoduché rozlišení, jak je znázorněno na obrázku níže, lineární amplifikace a používá pouze 1 primer, exponenciální amplifikace b má 2 primery.

Lineární RCA se také nazývá RCA s jedním primerem.Primer se váže na kruhovou DNA a je prodloužen působením DNA polymerázy.Produkt je lineární jednovláknový řetězec s velkým počtem opakujících se sekvencí tisíckrát delších než jedna smyčka.

Protože produkt lineárního RCA je vždy spojen se startovacím primerem, je hlavní výhodou snadná fixace signálu.

Exponenciální RCA, také známá jako Hyper větvená amplifikace HRCA (Hyper větvená RCA), v exponenciální RCA jeden primer amplifikuje produkt RCA, druhý primer hybridizuje s produktem RCA a prodlužuje se a náhrada je již navázána na produkt RCA. Následné primery prodlužují řetězec a opakují prodlužování a nahrazování za vzniku denmplifikačního produktu RCA a.

Výhody a nevýhody amplifikace nukleové kyseliny s rotujícím kruhem

Výhody RCA:

Vysoká citlivost, dobrá specifičnost a snadná obsluha.

Nedostatky RCA:

Problémy na pozadí během detekce signálu.Během RCA reakce mohou necirkulovaná sonda visacího zámku a templátová DNA nebo RNA nenavázané sondy generovat určité signály pozadí. 

Namplifikace na bázi sekvence ucleicacid

Amplifikace založená na sekvenci nukleové kyseliny (NASBA) je nová technologie vyvinutá na základě PCR.Je to kontinuální a izotermická amplifikace nukleové kyseliny řízená párem primerů se sekvencí promotoru T7.Technologie může amplifikovat templátovou RNA přibližně 109krát za přibližně 2 hodiny, což je 1000krát více než konvenční metoda PCR a nevyžaduje speciální vybavení.

Tato technologie byla použita pro rychlou diagnostiku onemocnění, jakmile se objevila, a mnoho společností v současné době používá tuto metodu v soupravách pro detekci RNA.

Ačkoli amplifikace RNA může také využívat technologii PCR s reverzní transkripcí, NASBA má své vlastní výhody: lze ji provádět za relativně konstantních teplotních podmínek a je stabilnější a přesnější než tradiční technologie PCR.

Reakce probíhá při 41 stupních Celsia a k dokončení vyžaduje AMV (virus ptačí myeloblastózy) reverzní transkriptázu, RNázu H, T7 RNA polymerázu a pár primerů.

Proces zahrnuje především:

Dopředný primer obsahuje komplementární sekvenci promotoru T7.Během reakce se dopředný primer váže na řetězec RNA a je katalyzován enzymem AMV za vzniku dvouřetězce DNA-RNA.

RNáza H štěpí RNA v hybridním dvouvláknovém řetězci a zachovává jednořetězcovou DNA.

Působením reverzního primeru a enzymu AMV se vytvoří dvouvlákno DNA obsahující sekvenci promotoru T7.

Působením T7 RNA polymerázy je proces transkripce dokončen a vzniká velké množství cílové RNA.

Výhody NASBA:

(1) Jeho primer má sekvenci promotoru T7, ale cizí dvouvláknová DNA nemá sekvenci promotoru T7 a nemůže být amplifikována, takže tato technologie má vysokou specificitu a citlivost.

(2) NASBA přímo začleňuje proces reverzní transkripce do amplifikační reakce, čímž zkracuje reakční dobu.

Nevýhody NASBA:

(1) Reakční složky jsou složitější.

(2) Pro zvýšení reakčních nákladů jsou zapotřebí tři druhy enzymů.