Real Time PCR, také známá jako kvantitativní PCR nebo qPCR, je metoda pro monitorování a analýzu amplifikačních produktů PCR v reálném čase.
Protože kvantitativní PCR má výhody jednoduchého ovládání, rychlé a pohodlné, vysoké citlivosti, dobré opakovatelnosti a nízké míry kontaminace, je široce používána v lékařském testování, hodnocení účinnosti léčiv, výzkumu genové exprese, transgenního výzkumu, detekce genů, detekce patogenů, detekce zvířat a rostlin., testování potravin a další obory.
Ať už se tedy zabýváte základním výzkumem v biologických vědách, nebo zaměstnanci farmaceutických společností, chovatelských společností, potravinářských společností nebo dokonce zaměstnanci vstupních a výstupních inspekcí a karanténních úřadů, oddělení monitorování životního prostředí, nemocnic a dalších útvarů, budete více či méně vystaveni Nebo potřebujete znát znalosti o zvládnutí kvantitativní PCR.

Princip Real Time PCR

Real Time PCR je metoda, při které se do reakčního systému PCR přidávají fluorescenční látky a intenzita fluorescenčního signálu v procesu PCR reakce je v reálném čase sledována pomocí kvantitativního PCR přístroje a nakonec jsou analyzována a zpracována experimentální data.

【Amplifikační křivka】je křivka popisující dynamický proces PCR.Amplifikační křivka PCR ve skutečnosti není standardní exponenciální křivka, ale esovitá křivka.

[Plošinová fáze amplifikační křivky]S nárůstem počtu cyklů PCR, inaktivací DNA polymerázy, vyčerpáním dNTP a primerů a inhibicí syntézní reakce pyrofosfátem jako vedlejším produktem reakce atd. se PCR ne vždy exponenciálně rozšiřuje.a nakonec vstoupí na náhorní plošinu.

[Exponenciální růstová oblast křivky amplifikace]Ačkoli se fáze plateau velmi liší, v určité oblasti oblasti exponenciálního růstu amplifikační křivky je opakovatelnost velmi dobrá, což je velmi důležité pro kvantitativní analýzu PCR.

[Hodnota prahu a hodnota Ct]Mezní hodnotu detekce fluorescence jsme nastavili na příslušnou pozici v oblasti exponenciálního růstu amplifikační křivky, a to prahovou hodnotu (Threshold).Průsečík prahové hodnoty a amplifikační křivky je hodnota Ct, to znamená, že hodnota Ct se vztahuje k počtu cyklů (Threshold Cycle), kdy je prahová hodnota dosažena.

Níže uvedený graf jasně ukazuje vztah mezi prahovou linií a amplifikační křivkou, prahovou hodnotou a hodnotou Ct.

【Jak kvantifikovat?】

Matematickou teorií bylo prokázáno, že hodnota Ct má inverzní lineární vztah k logaritmu počtu výchozích šablon.Real Time PCR monitoruje produkty PCR amplifikace v reálném čase a kvantifikuje je během fáze exponenciální amplifikace.

Pro každý cyklus PCR se DNA zvýšila exponenciálně 2krát a brzy dosáhla plató.

Za předpokladu, že množství výchozí DNA je A₀ po n cyklech lze teoretické množství produktu DNA vyjádřit jako:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Potom, čím větší je počáteční množství DNA Ao, tím dříve množství amplifikovaného produktu dosáhne detekční hodnoty An a počet cyklů při dosažení An je hodnota Ct.To znamená, že čím větší je počáteční množství DNA Ao, tím dříve vrcholí amplifikační křivka a odpovídajícím způsobem je požadovaný počet cyklů n menší.

Provedeme gradientové ředění standardu o známé koncentraci a použijeme jej jako templát pro Real Time PCR a získáme řadu amplifikačních křivek ve stejných intervalech v pořadí výchozího množství DNA od více po méně.Podle lineárního vztahu mezi hodnotou Ct a logaritmem počtu startovacích šablon a[standardní křivka] lze vytvořit .

Dosazením hodnoty Ct vzorku s neznámou koncentrací do standardní křivky lze získat počáteční templátové množství vzorku s neznámou koncentrací, což je kvantitativní princip Real Time PCR.

Detekční metoda Real Time PCR

Real Time PCR detekuje produkty PCR amplifikace detekcí intenzity fluorescence v reakčním systému.

Princip metody zalévání fluorescenčního barviva】

Fluorescenční barviva, jako je TB Green®, se může nespecificky vázat na dvouvláknovou DNA v systémech PCR a po navázání fluoreskovat.

Intenzita fluorescence v reakčním systému rostla exponenciálně s nárůstem cyklů PCR.Detekcí intenzity fluorescence lze v reálném čase monitorovat množství amplifikace DNA v reakčním systému a následně zpětně odhadnout množství výchozího templátu ve vzorku.

【Princip metody fluorescenční sondy】

fluorescenční sondaje sekvence nukleové kyseliny s fluorescenční skupinou na 5' konci a zhášecí skupinou na 3' konci, která se může specificky vázat na templát.Když je sonda intaktní, fluorescence emitovaná fluoroforem je zhášena zhášecí skupinou a nemůže fluoreskovat.Když je sonda rozložena, fluorescenční látka disociuje a emituje fluorescenci.

Do reakčního roztoku PCR se přidá fluorescenční sonda.Během procesu nasedání se fluorescenční sonda naváže na specifickou pozici templátu.Během procesu extenze může 5′→3′ exonukleázová aktivita enzymu PCR rozložit fluorescenční sondu hybridizovanou s templátem a fluorescenční látka je disociována, aby emitovala fluorescenci.Detekcí intenzity fluorescence sondy v reakčním systému lze dosáhnout účelu monitorování amplifikačního množství produktu PCR.

【Výběr metody fluorescenční detekce】

Pokud se používá k rozlišení sekvencí s vysokou homologií a provádění multiplexní PCR detekce, jako je analýza typizace SNP, je metoda fluorescenční sondy nenahraditelná.
Pro další experimenty Real Time PCR lze použít jednoduchou, snadnou a levnou fluorescenční chimérní metodu.

sondySilná specificita, schopná multiplexní PCR

Nedostatek

Požadavky na vysokou specificitu pro amplifikaci;

nelze provést multiplexní PCRPotřeba navrhnout specifické sondy, vysoká cena;

někdy je návrh sondy obtížný

Související produkty: