Hodnota Ct je nejdůležitější formou prezentace výsledků fluorescenční kvantitativní PCR.Používá se k výpočtu rozdílů v genové expresi nebo počtu kopií genu.Jaká je tedy hodnota Ct kvantifikace fluorescence považována za rozumnou?Jak zajistit efektivní rozsah hodnoty Ct?
Co je hodnota Ct?
Během procesu amplifikace qPCR odpovídající počet cyklů amplifikace (Cycle Threshold), když fluorescenční signál amplifikovaného produktu dosáhne nastaveného prahu fluorescence.C znamená Cycle a T znamená Threshold.Jednoduše řečeno, hodnota Ct je počet cyklů odpovídající tomu, kdy počáteční templátová amplifikace dosáhne určitého množství produktu v qPCR.Takzvané „určité množství produktu“ bude dále vysvětleno později.
Co dělá hodnota Ct?
1. Vztah mezi exponenciální amplifikací, množstvím šablony a hodnotou Ct
V ideálním případě jsou geny v qPCR akumulovány exponenciální amplifikací po určitém počtu cyklů.Vztah mezi počtem amplifikačních cyklů a množstvím produktů je: Množství amplifikovaného produktu = počáteční množství templátu × (1+En) počet cyklů.Reakce qPCR však není vždy v ideální situaci.Když množství amplifikovaného produktu dosáhne „určitého množství produktu“, počet cyklů v tomto okamžiku je hodnota Ct a je v periodě exponenciální amplifikace.Vztah mezi hodnotou Ct a množstvím počáteční šablony: Mezi hodnotou Ct šablony a logaritmem čísla počáteční kopie šablony existuje lineární vztah.Čím vyšší je počáteční koncentrace templátu, tím menší je hodnota Ct;čím nižší je počáteční koncentrace templátu, tím větší je hodnota Ct.
2.Křivka amplifikace, práh fluorescence a určité množství produktu PCR
Množství produktu amplifikace qPCR je přímo prezentováno ve formě fluorescenčního signálu, tj. amplifikační křivky.V rané fázi PCR je amplifikace za ideálních podmínek, počet cyklů je malý, akumulace produktu je malá a úroveň fluorescence nelze jasně odlišit od fluorescenčního pozadí.Poté se fluorescence zvyšuje a vstupuje do exponenciální fáze.Množství PCR produktu lze detekovat v určitém okamžiku, kdy je PCR reakce právě v exponenciální fázi, což lze použít jako „určité množství produktu“ a z toho lze odvodit počáteční obsah templátu.Proto intenzita fluorescenčního signálu odpovídající určitému množství produktu je prahem fluorescence.
V pozdní fázi PCR již amplifikační křivka nevykazuje exponenciální amplifikaci a vstupuje do lineární fáze a fáze plató.
3. Reprodukovatelnost hodnot Ct
Když cyklus PCR dosáhne čísla cyklu hodnoty Ct, právě vstoupil do skutečné exponenciální amplifikační periody.V tuto chvíli nebyla amplifikována malá chyba, takže reprodukovatelnost hodnoty Ct je vynikající, to znamená, že stejná šablona je amplifikována v různých časech nebo v různých zkumavkách ve stejnou dobu.Amplifikace, získaná hodnota Ct je konstantní.
1.Účinnost zesílení En
Účinnost amplifikace PCR se týká účinnosti, se kterou polymeráza převádí gen, který má být amplifikován, na amplikon.Účinnost amplifikace při transformaci jedné molekuly DNA na dvě molekuly DNA je 100 %.Účinnost amplifikace se běžně vyjadřuje jako En.Pro usnadnění analýzy následujících článků jsou stručně představeny faktory, které ovlivňují účinnost zesílení.
| Ovlivňující faktory | vysvětlení | Jak soudit? |
| A. Inhibitory PCR | 1. Templátová DNA obsahuje látky, které inhibují PCR reakci, jako jsou proteiny nebo detergenty.2. cDNA po reverzní transkripci obsahuje vysokou koncentraci složek templátové RNA nebo RT činidla, které mohou také inhibovat následnou PCR reakci. | 1. Zda dochází ke znečištění, lze posoudit měřením poměru A260/A280 a A260/A230 nebo elektroforézou RNA.2. Zda je cDNA po reverzní transkripci naředěna podle určitého poměru. |
| B. Nesprávný návrh základního nátěru | Základní nátěry nežíhají účinně | Zkontrolujte primery, zda neobsahují dimery primerů nebo vlásenky, nesoulad a někdy překlenující intronic návrhy. |
| C. Nesprávný návrh programu reakce PCR | 1. Primery nemohou účinně žíhat2. Nedostatečné uvolňování DNA polymerázy 3. Snížila se dlouhodobá vysokoteplotní aktivita DNA polymerázy | 1. Teplota žíhání je vyšší než hodnota TM primeru2. Doba předdenaturace je příliš krátká 3. Doba každé fáze reakčního postupu je příliš dlouhá |
| D. Nedostatečné promíchání činidel nebo chyby při pipetování | V reakčním systému je lokální koncentrace složek PCR reakce příliš vysoká nebo nerovnoměrná, což vede k neexponenciální amplifikaci PCR amplifikace | |
| E. Délka amplikonu | Délka amplikonu je příliš dlouhá, přesahuje 300 bp, a účinnost zesílení je nízká | Zkontrolujte, zda je délka amplikonu mezi 80-300 bp |
| F. Vliv činidel qPCR | Koncentrace DNA polymerázy v činidle je nízká nebo koncentrace iontů v pufru není optimalizována, což má za následek, že aktivita enzymu Taq nedosahuje maxima | Stanovení účinnosti amplifikace pomocí standardní křivky |
2.Rozsah hodnot Ct
Hodnoty Ct se pohybují v rozmezí 15-35.Pokud je hodnota Ct nižší než 15, má se za to, že amplifikace je v rozsahu základního období a prahu fluorescence nebylo dosaženo.V ideálním případě existuje lineární vztah mezi hodnotou Ct a logaritmem počátečního počtu kopií šablony, tj. standardní křivky.Prostřednictvím standardní křivky, kdy je účinnost amplifikace 100 %, je vypočtená hodnota Ct pro kvantifikaci počtu jednotlivých kopií genu kolem 35. Pokud je větší než 35, je počáteční počet kopií templátu teoreticky menší než 1, což lze považovat za nesmyslné.
Pro různé rozsahy Ct genu je kvůli rozdílu v počtu kopií genu a účinnosti amplifikace v počátečním množství templátu nutné vytvořit standardní křivku pro gen a vypočítat lineární rozsah detekce genu.
3. Faktory ovlivňující hodnotu Ct
Ze vztahu mezi počtem amplifikačních cyklů a množstvím produktu: množství amplifikovaného produktu = množství počátečního templátu × (1+En) počet cyklu lze vidět, že za ideálních podmínek bude mít množství počátečního templátu a En negativní dopad na hodnotu Ct.Rozdíl v kvalitě templátu nebo účinnosti amplifikace způsobí, že hodnota Ct bude příliš velká nebo příliš malá.
4. Hodnota Ct je příliš velká nebo příliš malá
Čas odeslání: 22. února 2023
