V experimentech qPCR je velmi důležitým článkem také návrh primeru.Zda jsou primery vhodné nebo ne, úzce souvisí s tím, zda účinnost amplifikace dosahuje standardu, zda jsou amplifikované produkty specifické a zda jsou dostupné experimentální výsledky.
Jak tedy zlepšit specificitu primeru qPCR?Vysoká účinnost zesílení?
Dnes vás vezmeme, abyste společně navrhli primery qPCR a nechejte navrhnout primery qPCR, aby se staly účinnou dovedností v experimentech.
Při navrhování primerů qPCR obvykle věnujte pozornost následujícím bodům: primery by měly být navrženy co nejvíce napříč introny, délka produktu by měla být 100–300 bp, hodnota Tm by měla být co nejblíže 60 °C a primery upstream a downstream by měly být co nejblíže a konec primeru by měl být G nebo C atd.
1. Návrh primerů zahrnujících introny
Při navrhování primerů qPCR může výběr primerů navržených napříč introny zabránit amplifikaci templátu gDNA a všechny produkty jsou odvozeny z amplifikace cDNA, čímž se eliminuje vliv kontaminace gDNA.
2. Délka primeru
Délka primeru je obecně mezi 18-30 nt a délka amplifikačního produktu by měla být co nejvíce řízena mezi 100-300 bp.
Pokud je primer příliš krátký, povede to k nespecifické amplifikaci, a pokud je příliš dlouhý, snadno vytvoří sekundární strukturu (jako je vlásenka).Pokud je produkt amplifikace příliš dlouhý, není vhodný pro reakci polymerázy, která ovlivní účinnost amplifikace PCR.
3. Obsah GC a hodnota Tm
Obsah GC v primerech by měl být řízen mezi 40 % a 60 %.Pokud je příliš vysoká nebo příliš nízká, nepřispívá to k zahájení reakce.Obsah GC dopředných a reverzních primerů by měl být téměř stejný, aby se získala stejná hodnota Tm a teplota nasedání.
Hodnota Tm by měla být pokud možno mezi 55-65 °C, obecně kolem 60 °C, a hodnota Tm proti proudu a po proudu by měla být co nejblíže, nejlépe ne více než 4 °C.
4. Vyvarujte se výběru A na 3′ konci primeru
Když je 3' konec primeru špatně spárován, existují velké rozdíly v účinnosti syntézy různých bází.Když je poslední bází A, může také zahájit syntézu řetězce i v případě nesprávného párování, a když je poslední bází T When , účinnost indukce nesprávného párování je značně snížena.Proto se snažte vyhnout volbě A na 3′ konci primeru a je lepší zvolit T.
Pokud se jedná o primer sondy, 5′ konec sondy nemůže být G, protože i když je jedna G báze připojena k fluorescenční reportérové ​​skupině FAM, G může také uhasit fluorescenční signál emitovaný skupinou FAM, což vede k falešně negativním výsledkům.Objevit.
5. Základní rozdělení
Distribuce čtyř bází v primeru je výhodně náhodná, vyhýbá se více než 3 po sobě jdoucím G nebo C na 3' konci a více než 3 po sobě jdoucímG nebo C lze snadno vytvořit párování v oblasti sekvence bohaté na GC.
6. Oblast návrhu primeru by se měla vyhýbat složitým sekundárním strukturám.
Sekundární struktura tvořená jedním vláknem amplifikačního produktu ovlivní hladký průběh PCR.Předpovídáním, zda je v cílové sekvenci sekundární struktura, se pokuste vyhnout se této oblasti při návrhu primerů.
7. Primery samotné a mezi primery by se měly snažit vyhnout po sobě jdoucím komplementárním bázím.
Mezi samotným primerem a primerem nemůže existovat žádná po sobě jdoucí komplementarita 4 bází.Samotný primer by neměl mít komplementární sekvenci, jinak se sám složí a vytvoří vlásenkovou strukturu, která ovlivní nasedací kombinaci primeru a templátu.
Komplementární sekvence nemohou existovat mezi upstream a downstream primery.Komplementarita mezi primery vytvoří dimery primerů, které sníží účinnost PCR a dokonce ovlivní kvantitativní přesnost.Pokud jsou struktury primer-dimer a vlásenka nevyhnutelné, hodnota △G by neměla být příliš vysoká (měla by být nižší než 4,5 kcal/mol).
8. Primery amplifikují cílový specifický produkt.
Konečným cílem detekce qPCR je porozumět množství cílového genu.Pokud dojde k nespecifické amplifikaci, kvantifikace bude nepřesná.Proto po navržení primerů je třeba je otestovat pomocí BLAST a v databázi sekvencí se porovná specifita produktů.
Dále vezmeme jako příklad pro návrh primerů qPCR lidský gen GAS6 (specifický 6 pro zastavení růstu).
01 dotazovací gen
Homo GAS6prostřednictvím NCBI.Zde bychom měli věnovat pozornost srovnání názvu genu a druhu, abychom zajistili, že jsou konzistentní.
02 Najděte sekvenci genů
(1) Pokud je cílovou sekvencí genomová DNA, vyberte první, což je sekvence genomové DNA genu.
(2) Pokud je cílová sekvence mRNA, vyberte druhou.Po zadání klikněte na „CDS“ v tabulce níže.Sekvence hnědého pozadí je kódující sekvence genu.
03 Základní nátěry
Vstupte do rozhraní Primer-BLAST
Zadejte sekvenční číslo genu nebo sekvenci ve formátu Fasta vlevo nahoře a vyplňte příslušné parametry.

Klikněte na „Get primers“ a objeví se NCBI, která vám sdělí, že takový výběr parametrů bude zesílen na další varianty sestřihu.Můžeme zkontrolovat různé varianty sestřihu a odeslat je, abychom získali vhodný pár primerů (jak je znázorněno na obrázku níže).Tento proces může trvat desítky sekund.
Teploty nasedání těchto párů primerů jsou všechny kolem 60 °C.Podle účelu experimentu vybírejte pro experiment primery se střední délkou, dobrou specificitou a menší samokomplementací primerů a úspěšnost je poměrně vysoká!
04Ověření specifičnosti primeru
Ve skutečnosti může Primer-Blast kromě návrhu primerů také vyhodnotit primery, které jsme sami navrhli.Vraťte se na stránku návrhu primeru, zadejte upstream a downstream primery, které jsme navrhli, a ostatní parametry nebudou upravovány.Po odeslání můžete vidět, zda pár primerů existuje i na jiných genech.Pokud jsou všechny zobrazeny na genu, který chceme amplifikovat, což naznačuje, že specificita tohoto páru primerů je skvělá!(Například toto je jediný výsledek dotazu na primer!)

05 Posouzení kvality základního nátěru
Jaký druh primeru je „dokonalý“ primer, který kombinuje „účinnost amplifikace na úrovni standardu“, „amplifikované charakteristiky produktu“ a „spolehlivé experimentální výsledky“?
Účinnost zesílení

křivka tání
Amplifikační účinnost primerů dosahuje 90%-110%, což znamená, že účinnost amplifikace je dobrá a křivka tání má jeden pík a obvykle Tm>80°C, což znamená, že amplifikační specificita je dobrá.
 
Související produkty:
Real Time PCR Easy – SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman