Věřím, že každý se při provádění PCR reakcí vždy setká s takovými nebo podobnými problémy, ale většinu z nich lze rozdělit do dvou hlavních problémů:

Příliš malá amplifikace genového templátu (amplifikace);
Příliš mnoho necílové genové amplifikace.
Použití přísad je jednou z běžných strategií k řešení těchto problémů.Úloha přísad má obvykle dva aspekty:
sekundární strukturagenů (sekundární struktura);
Omezte nespecifické primování.
Dnes vám redaktor stručně představí běžná aditiva v PCR reakcích a jejich funkce.
Přísady, které snižují sekundární strukturu
sulfoxid(DMSO)
vzorky genůs vysokým obsahem GC.DMSO však také značně snižuje aktivitu Taq polymerázy.Proto musí každý vyvážit přístupnost templátu a aktivitu polymerázy.Editor navrhuje, že můžete vyzkoušet různé koncentrace DSMO, například od 2 % do 10 %, abyste našli koncentraci, která vyhovuje vašemu experimentu.
Neiontové detergenty
Neiontové detergenty, jako je 0,1-1% Triton X-100, Tween 20 nebo NP-40, obvykle redukují sekundární strukturu DNA.Ačkoli to může zvýšit amplifikaci templátového genu, způsobí to také potíže s nespecifickou amplifikací.Takže tato aditiva fungují dobře pro reakce PCR s nízkým výtěžkem bez úlomků, ale ne tak dobře pro relativně nečisté reakce PRC.Další výhodou neiontových detergentů je snížení kontaminace SDS.Obvykle během procesu extrakce DNA bude SDS uveden do kroku PCR, což značně inhibuje aktivitu polymerázy.Proto přidání 0,5 % Tween-20 nebo Tween-40 do reakce může neutralizovat negativní účinky SDS.
Betain_
Betain může zlepšit amplifikaci DNA snížením tvorby sekundární struktury a je obecně „záhadným“ doplňkem komerčních PCR kitů.Pokud chcete použít betain, měli byste dát betain nebo monohydrát betainu (betain nebo monohydrát betainu), ale ne hydrochlorid betainu (betain HCl), upravte na konečnou koncentraci 1-1,7M.Betain může také pomoci zlepšit specificitu, protože eliminuje závislost na složení párů bází tání DNA/denaturace DNA.
Aditiva pro snížení nespecifického základního nátěru
formamid
Formamid je běžně používané organické PCR aditivum.Může se kombinovat s hlavní drážkou a malou drážkou v DNA, čímž se sníží stabilita dvojité šroubovice hlavní DNA a sníží se teplota tání DNA.Koncentrace formamidu používaná v PCR experimentech je obvykle 1%-5%.
tetramethylchlorid amonný( TMAC)
Tetramethylamoniumchlorid může zvýšit specificitu hybridizace (hybridizační specificitu) a zvýšit teplotu tání DNA.TMAC tedy může odstranit nespecifické priming a snížit chybné navázání DNA a RNA.Pokud použijetedegenerované primeryv reakci PCR nezapomeňte přidat TMAC, který se běžně používá v koncentraci 15-100 mM.
Další běžné přísady
Kromě dvou výše uvedených kategorií aditiv existuje v PCR reakcích mnoho běžných aditiv, i když mají různé funkce, jsou také velmi důležité.
Hořčíkový iont
Hořčíkový iont je nepostradatelný kofaktor (kofaktor) polymerázy, to znamená, že bez hořčíkového iontu je polymeráza neaktivní.Avšak příliš mnoho hořčíkových iontů může také ovlivnit účinnost polymerázy.Koncentrace hořčíkových iontů v každé PCR reakci se bude lišit.Chelatační činidla (jako je EDTA nebo citrát), koncentrace dNTP a proteinů ovlivňují koncentraci hořčíkových iontů.Pokud tedy máte s experimentem PCR problémy, můžete zkusit změnit různé koncentrace hořčíkových iontů, například z 1,0 na 4,0 mM, s intervalem 0,5–1 mM mezi nimi.
Stojí za zmínku, že více cyklů zmrazování a rozmrazování může vést ke koncentrační stratifikaci roztoku chloridu hořečnatého.Před každým použitím jej proto musíte zcela rozpustit a před použitím dobře promíchat.
Hovězí sérový albumin(Hovězí albumin, BSA)
V experimentech molekulární chemie je hovězí sérový albumin velmi běžnou přísadou, zejména při štěpení restrikčními enzymy a experimentech PCR.V PCR reakcích je BSA užitečný při snižování kontaminantů, jako jsou fenolické sloučeniny.A také se říká, že dokáže snížit přilnavost reaktantů ke stěně zkumavky.V PCR reakci může obvykle koncentrace přidaného BSA dosáhnout 0,8 mg/ml.
 
Související produkty:
Hrdina PCR(s barvivem)
Hrdina PCR