Ověření výkonu primerů a sond v rané fázi PCR činidel a stanovení nejvhodnějších reakčních podmínek jsou předpoklady pro zajištění hladkého průběhu formálních experimentů.
Jak tedy potřebujeme potvrdit primer sondu v raném stádiu?
Hlavními ukazateli jsou základní linie, amplifikační křivka, hodnota ct, účinnost amplifikace, detekce vzorku s nízkou koncentrací, CV atd.
Základní linie
Základní čára je vodorovná čára v křivce amplifikace PCR.V prvních několika cyklech amplifikační reakce PCR se fluorescenční signál příliš nemění a tvoří přímku.Tato přímka je základní linií.
Při screeningu sond PCR primerů věnujte pozornost tomu, zda je základní linie vyrovnaná.Čistota koncentrace primérové sondy ovlivní základní linii, například způsobí zvýšení nebo snížení základní linie.Základní čára je také velmi intuitivní ukazatel.
Křivka zesílení
Dalším intuitivním indikátorem je tvar křivky zesílení.Nejlepší je mít křivku ve tvaru S, aby se zabránilo sekundární amplifikaci nebo jiným abnormálním amplifikačním křivkám.
Hodnota Ct
Počet cyklů odpovídajících inflexnímu bodu od základní linie k exponenciálnímu růstu je hodnota Ct.
Pro stejný vzorek vedou různé primerové sondy k různým amplifikačním křivkám a odpovídající hodnota Ct bude ovlivněna účinností amplifikace a stupněm interference.Teoreticky čím menší hodnotu Ct primerové sondy zvolíme, tím lépe.
Účinnost zesílení
Jednou z nejspolehlivějších a nejstabilnějších metod pro hodnocení účinnosti amplifikace PCR je standardní křivka, která je také široce uznávána výzkumníky.Způsob zahrnuje vytvoření série vzorků pro kontrolu relativního počtu cílových templátů.Tyto vzorky se obvykle vyrábějí sériovým ředěním koncentrovaných zásobních roztoků, nejčastěji se používá 10násobné ředění.Pomocí série naředěných vzorků, pomocí standardního programu qPCR k amplifikaci pro získání hodnoty Cq a nakonec nakreslení standardní křivky podle koncentrace každého vzorku a odpovídající hodnoty Cq pro získání lineární rovnice Cq= -klgX0+b, a účinnosti amplifikace E=10(-1 /k)-1.Při použití qPCR pro kvantitativní analýzu je požadováno, aby účinnost amplifikace byla v rozmezí 90 %-110 % (3,6>k>3,1).
Detekce vzorků s nízkou koncentrací
Když je koncentrace vzorku nízká, jsou rychlosti detekce různých primerových sond různé.Vybíráme 20 vzorků s nízkou koncentrací k replikaci a systém primer-sonda s nejvyšší mírou detekce je nejlepší.
Variační koeficient (CV)
10 duplicitních vzorků může být detekováno různými primerovými sondami podle standardu linie činidla pro detekci amplifikace nukleové kyseliny.
Kvantitativní činidla:
Přesnost
Přesnost v rámci jedné šarže by měla splňovat: variační koeficient (CV, %) logaritmické hodnoty zkušební koncentrace je ≤ 5 %.Když je koncentrace vzorku nízká, variační koeficient (CV, %) logaritmu detekční koncentrace je ≤10 %
Kvalitativní činidla:
Přesnost
Přesnost v rámci jedné dávky by měla splňovat:
(1) Variační koeficient hodnoty Ct (CV, %) ≤ 5 %
Stejný vzorek se testuje paralelně 10krát a výsledky testu by měly být konzistentní
Čas odeslání: 18. září 2021
