Autoři: Wang Xiaoyan, Zhao Eryu

Jednotka: Jiaozhou Hospital, Dongfang Hospital Přidružená k Tongji University

V současnosti je hlavním typem vzorku pro detekci nukleové kyseliny respiračního patogenu výtěr z krku.Existuje mnoho druhů běžně používaných roztoků pro uchování vzorků, z nichž všechny musí být chlazeny nebo zmraženy pro přepravu a skladování;Je obtížné kontrolovat celý proces nízké teploty během procesu odběru a přepravy a je obtížné zajistit kontrolu kvality před testováním vzorku^[1-2].

RNáza (RNáza) je endonukleáza, která hydrolyzuje RNA, hlavně přerušuje fosfodiesterové vazby mezi nukleotidy.Molekula RNázy je velmi stabilní, ve struktuře jsou disulfidové vazby a její aktivita nevyžaduje přítomnost dvojmocných kationtů, takže RNáza není snadno denaturována a lze ji snadno renaturovat i po vysoké teplotě nebo použití denaturantů.RNázy se dělí na endogenní a exogenní.Endogenní RNázy mohou být uvolněny ve stejnou dobu, když dojde k ruptuře buněk.Proto je eliminace role endogenních RNáz velmi kritickým krokem v procesu extrakce RNA.Exogenní RNázy jsou široce distribuovány.RNázy existují ve vzduchu, lidské kůži, vlasech a slinách, což jsou důležité důvody pro snadnou degradaci RNA^[3].

Dotaz na data

CANS-CL02-A009 „Aplikace pokynů pro akreditaci kvality a kompetence lékařské laboratoře v oblasti molekulární diagnostiky“ v technických požadavcích navrhuje, aby byly podle aplikace formulovány vhodné normy kvality vody;Jednorázové vzduchotěsné nádoby:

RNáza/klasifikace

(1) RNáza A

Ribonukleáza A (RNáza A), odvozená z hovězí slinivky, je endoribonukleáza, která může specificky atakovat 3' konec pyrimidinových zbytků na RNA, štěpí cytosin nebo uracil tvořený sousedními nukleotidy.Fosfodiesterová vazba, konečným produktem reakce je 3′ pyrimidinový nukleotid a oligonukleotid s 3′ pyrimidinovým nukleotidem na konci.

(2) RNáza T1

Ribonukleáza T1 (RNáza T1) je odvozena z Aspergillus orjzae, specificky působí na 3′-terminální fosfát guaninu a místo štěpení je mezi 3′ fosfátem guaninu a 5′ hydroxylem sousedních nukleotidů.Konečným produktem reakce je kyselina 3′guanylová a fragmenty oligonukleotidů s kyselinou 3′guanylovou na konci.

(3) RNáza H

Ribonukleáza H (RNáza H) byla poprvé objevena z tkáně telecího brzlíku a její kódující gen byl klonován do Escherichia coli.Dokáže specificky degradovat DNA: řetězce RNA v hybridních duplexech RNA, což vede k oligonukleotidům a mononukleotidům s 3′-OH a 5′-monofosfátovými konci, nemůže degradovat jedno- nebo dvouvláknovou DNA nebo RNA.

RNáza

Funkce a použití

Ribonukleáza může katalyzovat degradaci ribonukleové kyseliny (RNA) a může být uměle syntetizována.Léčivá mast se používá lokálně k léčbě traumatu a bolesti kloubů.Podle zpráv může ribonukleáza změnit metabolismus hostitelské buňky, inhibovat syntézu viru, inhibovat proliferaci viru chřipky in vitro a inhibovat tvorbu viru vakcínie a herpesu u kuřecích embryí.Klinické použití ribonukleázy denně intramuskulární injekcí 180 mg, prospěšné pro léčbu epidemické encefalitidy, může ribonukleáza katalyzovat degradaci ribonukleové kyseliny (RNA) a nyní může být uměle syntetizována.Léčivá mast se používá lokálně k léčbě traumatu a bolesti kloubů.Podle zpráv může ribonukleáza změnit metabolismus hostitelské buňky, inhibovat syntézu viru, inhibovat proliferaci viru chřipky in vitro a inhibovat tvorbu viru vakcínie a herpesu u kuřecích embryí.Klinické použití ribonukleázy denně intramuskulární injekce 180 mg je přínosné pro léčbu epidemické encefalitidy.

RNáza

Definice inhibitoru

Definice jednotky inhibitoru RNázy: Množství enzymu potřebné k inhibici 50 % aktivity 5 ng RNázy A je jedna jednotka.

Jak fungují inhibitory RNázy

Guanidin isothiokyanát:

Guanidin isothiokyanát je organická sloučenina s molekulovým vzorcem C2H6N4S.Používá se hlavně v biologické medicíně, chemických činidlech atd. Guanidin isothiokyanát je činidlo lýzující protein a často se používá jako hlavní složka lyzačního roztoku v molekulárních diagnostických činidlech.Může lyzovat tkáň, zničit buněčnou strukturu a disociovat nukleovou kyselinu z nukleoproteinu a má silnou denaturaci na RNázu.V současnosti je nejúčinnějším inhibitorem RNázy.

TRIzol je nové činidlo pro extrakci celkové RNA, které může přímo extrahovat celkovou RNA z buněk nebo tkání.Obsahuje látky jako fenol a guanidinisothiokyanát, které dokážou rychle narušit buňky a inhibovat nukleázy uvolňované buňkami.

(Nicméně isothiokyanát guanidinu je nebezpečný pro zdraví laboratorních výzkumníků.)

RNasin:

Kyselý glykoprotein extrahovaný z jater potkana nebo lidského blastodermu.Rnasin je nekompetitivní inhibitor RNázy, který se může vázat na různé RNázy a inaktivovat je.

(Další podrobnosti: https://www.foreivd.com/foreasy-rnase-inhibitor-product/)

Hvysoká teplota:

Vysoká teplota je také běžným prostředkem denaturace bílkovin.

Diethylpyrokarbonát (DEPC):

DEPC je silný, ale neúplný inhibitor RNázy, který může inhibovat aktivitu RNázy spojením s aminokyselinovým imidazolovým kruhem aktivní skupiny RNázy k denaturaci proteinů.

Vanadyl ribonukleosidový komplex:

Komplex tvořený ionty oxidu vanadu a nukleosidy, který se váže na RNázu ve formě přechodných látek, které mohou téměř úplně inhibovat aktivitu RNázy

jiný:

SDS, močovina, křemelina atd. mají také určitý inhibiční účinek na RNázu.

Odborné posudky

Li Yujie hlavní technik

Ředitel laboratorního oddělení, nemocnice Jiaozhou, nemocnice Dongfang Přidružená k univerzitě Tongji

Aby se zabránilo biodegradaci exogenní RNázy, měly by se během procesu extrakce RNA často nosit a vyměňovat masky, rukavice a čepice.Veškeré sklo se musí péct v sušicí peci při 200 °C déle než 2 hodiny.Materiály používané k pečení, jako jsou plasty, musí být ošetřeny DEPC vodou a poté omyty destilovanou vodou.Činidla nebo zařízení používaná pro extrakci, konzervaci a identifikaci RNA by měla být vyhrazena pro RNA a měla by být zřízena nezávislá oblast provozu RNA.

Reference:

[1] Smith-Vaughan HC, Binks MJ, Beissbarth J, et al.Bakterie a viry v nosohltanu bezprostředně před nástupem akutních infekcí dolních cest dýchacích u domorodých australských dětí[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2018, 37 (9): 1785-1794.

[2] Pobočka pro kontrolu nemocničních infekcí Čínské asociace preventivního lékařství.Směrnice pro odběr a kontrolu klinických mikrobiálních vzorků [J].Chinese Journal of Hospital Infection, 2018(20):3192-3200.

[3] „Klinický test deset tisíc Proč objem testů molekulární biologie“