V časném stadiu vypuknutí je vzhledem k rychlému vývoji rychlá diagnostika podezřelých pacientů klíčem k prevenci COVID-19.Některá schválená činidla pro detekci nukleových kyselin mají krátkou dobu vývoje a existují problémy, jako je uspěchané potvrzení výkonu, nedostatečná optimalizace činidel a velké rozdíly mezi šaržemi;Problémy různých klinických laboratoří v různých aspektech procesu detekce nukleových kyselin mohou také ovlivnit přesnost výsledků detekce nukleových kyselin.Tento článek se zaměří na klíčové odkazy a body současné detekce nukleových kyselin SARS-CoV-2 a analyzuje problémy falešně negativního a pozitivního opětovného vyšetření laboratorní detekce nukleových kyselin a klinické nekonzistence.

Principy detekce nukleových kyselin SARS-CoV-2

SARS-CoV-2 je RNA virus se sekvencí genomu asi 29 kb, s 10 geny, které mohou účinně kódovat 10 proteinů.Viry se skládají z RNA a proteinu a vnější vrstva je vnější obal složený z lipidů a glykoproteinů.Uvnitř proteinová kapsida do ní obalí RNA, čímž chrání snadno rozložitelnou RNA (P1).

P1 Struktura SARS-COV-2

Viry napadají buňky přes specifické buněčné povrchové receptory, aby způsobily infekci, a využívají hostitelské buňky k replikaci.

Principem detekce virové nukleové kyseliny je exponovat virovou RNA přes buněčný lyzát a poté použít k detekci fluorescenční reverzní transkripční polymerázovou řetězovou reakci (RT-PCR) v reálném čase.

Klíčem k principu detekce je použití primerů a sond k dosažení „cíleného párování“ sekvencí nukleových kyselin, to znamená k nalezení sekvence nukleové kyseliny SARS-CoV-2, která se liší od ostatních virů v přibližně 30 000 bázích (podobnost nukleové kyseliny k jiným virům), oblast „nízká“, navrhnout primery a sondy.

Primery a sondy jsou vysoce shodné se specifickou oblastí nukleové kyseliny SARS-CoV-2, to znamená, že specificita je velmi silná.Jakmile je výsledek amplifikace fluorescenční RT-PCR v reálném čase u testovaného vzorku pozitivní, prokáže se, že ve vzorku je přítomen SARS-CoV-2.Viz P2.

P2 Kroky stanovení nukleové kyseliny SARS-CoV-2 (fluorescenční RT-PCR v reálném čase)

Podmínky a požadavky laboratoře pro detekci nukleových kyselin SARS-CoV-2

Laboratoře pro testování nukleových kyselin jsou nejideálnější pro prostředí s podtlakem a měly by věnovat pozornost monitorování tlaku, udržovat proudění vzduchu a eliminovat aerosoly.Personál pro testování nukleových kyselin musí mít odpovídající kvalifikaci, musí projít příslušným školením o polymerázové řetězové reakci a projít hodnocením.Laboratoř by měla být přísně řízena, zónována a vstup irelevantního personálu by měl být přísně zakázán.Čistý prostor by měl být větraný a dezinfikován na místě.Příslušné položky jsou umístěny do zón, čisté a špinavé jsou odděleny, včas vyměněny a dekontaminovány na místě.Běžná dezinfekce: Pro větší plochy je hlavním řešením dezinfekční prostředek s obsahem chlóru, pro malé plochy lze použít 75% alkohol.Dobrým způsobem, jak se vypořádat s aerosoly, je otevřít okna pro větrání a dezinfekci vzduchu lze také provádět pomocí ultrafialových paprsků, filtrace a dezinfekce vzduchu.

Klíčové vazby a parametry stanovení nukleové kyseliny SARS-CoV-2 (fluorescenční RT-PCR v reálném čase)

Přestože laboratoře obecně věnují „detekci nukleových kyselin“ velkou pozornost, ve skutečnosti je „extrakce“ nukleové kyseliny také jedním z klíčových kroků úspěšné detekce, která úzce souvisí se sběrem a skladováním vzorků virů.

V současnosti nejpoužívanější respirační vzorky, jako jsou výtěry z nosohltanu, využívají druhou metodu, kterou je inaktivační (konzervační) roztok připravený na základě extrakce nukleové kyseliny a lyzačního roztoku.Na jedné straně může tento roztok pro konzervaci viru denaturovat protein viru, ztratit svou aktivitu a již není infekční a zlepšit bezpečnost ve fázi přepravy a detekce;na druhé straně může přímo rozbít virus, aby uvolnil nukleovou kyselinu, eliminoval enzym rozkládající nukleovou kyselinu a zabránil viru.RNA je degradována.

Roztok pro odběr vzorků viru připravený na bázi extrakčního lyzačního roztoku nukleové kyseliny.Hlavními složkami jsou vyvážené soli, chelatační činidlo kyseliny ethylendiamintetraoctové, sůl guanidinu (guanidin isothiokyanát, guanidin hydrochlorid atd.), aniontové povrchově aktivní činidlo (dodekan) síran sodný), kationtové povrchově aktivní činidlo (tetradecyl trimethyl amonium oxalát), fenol, 8- nebo více hydroxythreinitol, další složky dithio-hydroxythreolin, proteinV současné době existuje mnoho typů souprav pro extrakci nukleových kyselin a používají se různá činidla pro extrakci a čištění nukleových kyselin.I když se použije stejné extrakční a purifikační činidlo nukleové kyseliny, extrakční postupy každé soupravy se liší.

V současné době jsou produkty soupravy pro detekci nukleových kyselin schválené Národní správou léčivých přípravků vybírány na základě genů ORF1ab, E a N v genomu SARS-CoV-2.Principy detekce různých produktů jsou v zásadě stejné, ale jejich primery a konstrukce sond se liší.Existují segmenty s jedním cílem (ORF1ab), segmenty se dvěma cíli (ORF1ab, N nebo E) a segmenty se třemi cíli (ORF1ab, N a E).Rozdíl mezi detekcí a interpretací, extrakcí nukleových kyselin a fluorescenčním RT-PCR reakčním systémem v reálném čase by měl být uveden v příslušných pokynech k soupravě a doporučuje se, aby uživatelé přísně dodržovali interpretační metodu uvedenou v pokynech pro interpretaci soupravy.Společné oblasti, primery a sekvence sond amplifikované fluorescenční RT-PCR v reálném čase jsou ukázány na P3.

P3 Umístění cíle amplikonu SARS-CoV-2 na genomu a sekvence primerů a sond

Interpretace výsledků stanovení nukleové kyseliny SARS-CoV-2 (Real-Time fluorescenční RT-PCR)

„Plán prevence a kontroly pneumonie pro infekci SARS-CoV-2 (druhé vydání)“ poprvé objasnil kritéria pro posuzování výsledků amplifikace jednoho genu:

1. Žádné Ct nebo Ct≥40 je negativní;

2. Ct<37 je pozitivní;

3. Hodnota Ct 37-40 je oblast ve stupních šedi.Doporučuje se experiment opakovat.Pokud má výsledek předělání Ct<40 a amplifikační křivka zjevné vrcholy, vzorek je posouzen jako pozitivní, v opačném případě je negativní.“

Třetí vydání průvodce a čtvrté vydání průvodce pokračovaly ve výše uvedených kritériích.Vzhledem k různým cílům používaným v komerčních sestavách však výše uvedené 3. vydání příručky neuvádí kritéria pro stanovení kombinace cílů, přičemž je třeba zdůraznit, že pokyny poskytnuté výrobcem mají přednost.Počínaje 5. vydáním pokynů byly vyjasněny dva cíle, zejména kritéria posuzování pro jeden cíl, která je obtížné posoudit.To znamená, že pokud chce laboratoř potvrdit, že případ je pozitivní na detekci nukleové kyseliny SARS-CoV-2, musí být splněna 1 ze 2 podmínek:

(1) Dva cíle SARS-CoV-2 (ORF1ab, N) ve stejném vzorku jsou pozitivně testovány fluorescenční RT-PCR v reálném čase.Pokud je jeden cíl pozitivní, je vyžadováno opětovné odběry vzorků a nové testování.Pokud jsou výsledky testu Pokud je jediný cíl stále pozitivní, je hodnocen jako pozitivní.

(2) Dva vzorky fluorescenční RT-PCR v reálném čase vykázaly jeden cíl pozitivní ve stejnou dobu nebo dva vzorky stejného typu ukázaly jeden cílový pozitivní výsledek testu, který lze hodnotit jako pozitivní.Pokyny však také zdůrazňují, že negativní výsledky testování nukleových kyselin nemohou vyloučit infekci SARS-CoV-2.Je třeba vyloučit faktory, které mohou způsobit falešně negativní výsledky, včetně špatné kvality vzorku (respirační vzorky z orofaryngu a dalších částí), odběr vzorků příliš brzy nebo příliš pozdě, vzorky nebyly správně uloženy, transportovány a zpracovány a samotná technologie měla problémy (variace virů, inhibice PCR) atd.

Příčiny falešně negativních výsledků při detekci SARS-CoV-2

Pojem „falešně negativní“ v testování nukleových kyselin, o který se v současnosti jedná, často odkazuje na „falešně negativní“, ve kterých jsou výsledky testů nukleových kyselin v rozporu s klinickými projevy, to znamená, že klinické příznaky a výsledky zobrazení jsou vysoce podezřelé z COVID-19, ale testy nukleových kyselin jsou vždy mnohokrát „negativní“.Centrum klinické laboratoře Národní zdravotní komise vysvětlilo „falešně negativní“ test SARS-CoV-2.

(1) V buňkách infikované osoby je určité množství viru.Dosavadní údaje ukazují, že poté, co je tělo infikováno virem, virus se dostane do krku nosem a ústy, poté do průdušnice a průdušek a poté se dostane do alveol.Infikovaná osoba zažije inkubační dobu, mírné příznaky a poté proces závažných příznaků a různá stadia onemocnění.A množství viru přítomného v různých částech těla je různé.

Z hlediska virové zátěže buněčných typů, alveolární epiteliální buňky (dolní dýchací cesty)> epiteliální buňky dýchacích cest (horní dýchací cesty)> fibroblasty, endoteliální buňky a makrofágy atd.;z typu vzorku tekutina z alveolární laváže (nejlepší)>sputum s hlubokým kašlem>výtěr z nosohltanu>výtěr z orofaryngu>krev.Kromě toho lze virus detekovat také ve výkalech.S ohledem na pohodlí operace a akceptaci pacientů je však běžně používaným pořadím klinických vzorků orofaryngeální výtěr > výtěr z nosohltanu > tekutina z průduškové laváže (komplexní operace) a hluboké sputum (obvykle suchý kašel, obtížně dostupný).

Proto je množství viru v buňkách orofaryngu nebo nosohltanu některých pacientů malé nebo extrémně nízké.Pokud jsou k testování odebrány pouze vzorky orofaryngu nebo nosohltanu, virová nukleová kyselina nebude detekována.

(2) Během odběru vzorků nebyly odebrány žádné buňky obsahující virus nebo virová nukleová kyselina nebyla účinně uchována.

[① Nesprávné místo odběru, například při odběru orofaryngeálních výtěrů není hloubka odběru dostatečná, odebrané výtěry z nosohltanu nejsou odebírány hluboko v nosní dutině atd. Většina odebraných buněk mohou být buňky bez virů;

②Odběrové tampony se používají nesprávně.Například syntetická vlákna jako PE vlákno, polyesterové vlákno a polypropylenové vlákno se doporučují pro materiál tampónové hlavy.Ve skutečném provozu se používají přírodní vlákna, jako je bavlna (silná adsorpce bílkovin a není snadné je vymýt) A nylonová vlákna (špatná absorpce vody, což vede k nedostatečnému objemu vzorku);

③Nesprávné použití zkumavek pro ukládání virů, jako je nesprávné použití polypropylenových nebo polyetylenových plastových zkumavek, které snadno absorbují nukleové kyseliny (DNA/RNA), což vede ke snížení koncentrace nukleové kyseliny ve skladovacím roztoku.V praxi se pro skladování virových nukleových kyselin doporučuje používat polyetylen-propylenový polymerový plast a některé speciálně upravené polypropylenové plastové nádoby.]

[① Nesprávné místo odběru, například při odběru orofaryngeálních výtěrů není hloubka odběru dostatečná, odebrané výtěry z nosohltanu nejsou odebírány hluboko v nosní dutině atd. Většina odebraných buněk mohou být buňky bez virů;

②Odběrové tampony se používají nesprávně.Například syntetická vlákna jako PE vlákno, polyesterové vlákno a polypropylenové vlákno se doporučují pro materiál tampónové hlavy.Ve skutečném provozu se používají přírodní vlákna, jako je bavlna (silná adsorpce bílkovin a není snadné je vymýt) A nylonová vlákna (špatná absorpce vody, což vede k nedostatečnému objemu vzorku);

③Nesprávné použití zkumavek pro ukládání virů, jako je nesprávné použití polypropylenových nebo polyetylenových plastových zkumavek, které snadno absorbují nukleové kyseliny (DNA/RNA), což vede ke snížení koncentrace nukleové kyseliny ve skladovacím roztoku.V praxi se pro skladování virových nukleových kyselin doporučuje používat polyetylen-propylenový polymerový plast a některé speciálně upravené polypropylenové plastové nádoby.]

(4) Provoz klinické laboratoře není standardizován.Podmínky přepravy a skladování vzorků, standardizovaný provoz klinických laboratoří, interpretace výsledků a kontrola kvality jsou klíčovými faktory pro zajištění přesnosti a spolehlivosti výsledků testů.Podle výsledků externího hodnocení kvality provedeného Centrem klinických laboratoří Národní zdravotní komise ve dnech 16. – 24. března 2020 z 844 laboratoří, které obdržely platné výsledky, bylo kvalifikováno 701 (83,1 %) a 143 (16,9 %) nikoli.Kvalifikované, celkové laboratorní testovací podmínky jsou dobré, ale různé laboratoře mají stále rozdíly ve schopnosti obsluhy personálu, schopnosti interpretace pozitivních vzorků na jeden cíl a kontrole kvality.

Jak snížit falešnou negativitu detekce nukleové kyseliny SARS-CoV-2?

Snížení falešně negativních výsledků při detekci nukleových kyselin by mělo být optimalizováno ze čtyř aspektů vytváření falešně negativních výsledků.

(1)V buňkách infikované osoby je určité množství viru.Koncentrace viru v různých částech těla podezřelých nakažených osob se bude v různých časech lišit.Pokud není hltan, může být v tekutině z výplachu průdušek nebo ve výkalech.Pokud lze pro testování odebrat více typů vzorků ve stejnou dobu nebo v různých fázích progrese onemocnění, pomůže to vyhnout se falešným negativům.

(2) Buňky obsahující virus by měly být odebrány během odběru vzorků.Tento problém lze do značné míry řešit posílením školení sběračů vzorků.

(3) Spolehlivá činidla IVD.Prováděním výzkumu hodnocení detekční účinnosti činidel na národní úrovni a diskusí o stávajících problémech lze dále zlepšit účinnost detekce činidel a zlepšit citlivost analýzy.

(4) Standardizovaný provoz klinických laboratoří.Posílením školení laboratorního personálu, neustálým zlepšováním systému managementu kvality laboratoře, zajištěním rozumného dělení a zlepšováním schopnosti personálu detekce je možné omezit falešné negativity způsobené nesprávným laboratorním provozem.

Důvody opětovného pozitivního testu nukleové kyseliny SARS-CoV-2 u uzdravených a propuštěných pacientů

„Plán diagnostiky a léčby COVID-19 (Zkušební sedmé vydání)“ jasně stanoví, že jedním z kritérií pro pacienty s COVID-19, kteří mají být vyléčeni a propuštěni z nemocnice, je, že dva po sobě jdoucí vzorky z dýchacího traktu mají negativní test na nukleovou kyselinu (nejméně 24 hodin), ale existuje jen velmi málo SARS-CoV-2, protože test nukleových kyselin byl opět pozitivní z různých důvodů propuštěných pacientů.

(1)SARS-CoV-2 je nový virus.Je nutné dále porozumět jeho patogennímu mechanismu, úplnému obrazu způsobeného onemocnění a charakteristice průběhu onemocnění.Proto je na jedné straně nutné posílit management propuštěných pacientů a provádět 14denní lékařské pozorování.Provádějte sledování, sledování zdravotního stavu a zdravotní poradenství k prohloubení porozumění celému procesu vzniku, vývoje a výsledku onemocnění.

(2) Pacient může být znovu infikován virem.Akademik Zhong Nanshan řekl: Protože vyléčení pacienti mají protilátky, SARS-CoV-2 může být eliminován protilátkami, když znovu napadnou.Existuje mnoho důvodů, které mohou být příčinou uzdraveného pacienta, nebo mohou souviset s mutací viru nebo dokonce příčinou laboratorního vyšetření.Pokud se jedná o samotný virus, mutace SARS-CoV-2 může způsobit, že protilátka produkovaná uzdraveným pacientem bude neúčinná proti mutovanému viru.Pokud je pacient znovu infikován mutovaným virem, může být test na nukleovou kyselinu opět pozitivní.

(3)Pokud jde o laboratorní zkušební metody, každá zkušební metoda má svá omezení.Detekce nukleové kyseliny SARS-CoV-2 je způsobena volbou sekvence genu, složením reagencií, citlivostí metody a dalšími důvody, což vede k tomu, že stávající soupravy mají své vlastní nižší detekční limity.Po léčbě pacienta se virus v těle snižuje.Když je virová zátěž v testovaném vzorku pod spodním limitem detekce, objeví se „negativní“ výsledek.Tento výsledek však neznamená, že virus v těle zcela zmizel.Virus může být po ukončení léčby.Resurgence“, pokračujte v kopírování.Proto se doporučuje kontrola jednou týdně během 2 až 4 týdnů po propuštění.

(4) Nukleová kyselina je genetickým materiálem viru.Virus je zabit poté, co pacient podstoupil antivirovou léčbu, ale zbývající fragmenty virové RNA jsou stále zadržovány v lidském těle a nejsou zcela odstraněny z těla.Někdy, za určitých okolností, může být více zachována.Po dlouhou dobu a v tuto chvíli bude test nukleových kyselin „přechodně“ pozitivní.S prodlužováním doby zotavení pacienta, po postupném vyčerpání zbytkových fragmentů RNA v těle, může být výsledek testu nukleové kyseliny negativní.

(5) Výsledek testu nukleových kyselin SARS-CoV-2 pouze prokazuje přítomnost nebo nepřítomnost virové RNA a nemůže prokázat aktivitu viru a to, zda je virus přenosný.Je třeba prokázat, zda se pacient, který bude mít opět pozitivní test na nukleové kyseliny, opět stane zdrojem infekce.Je nutné provést kultivaci viru na klinických vzorcích a kultivovat „živý“ virus, aby se prokázalo, že je infekční.

souhrn

Stručně řečeno, nelze se zcela vyhnout falešně negativním testům nukleových kyselin SARS-CoV-2, pozitivním opakovaným testům a dalším stavům, které jsou v rozporu s klinickými projevy.Při vlastním screeningu a testování se doporučuje kombinovat klinické příznaky, zobrazovací vyšetření (CT) a experimenty Výsledky laboratorních testů (test nukleových kyselin + test na virus-specifické protilátky) pro komplexní diagnostiku, aby se předešlo promeškané diagnóze a chybné diagnóze.Pokud se zjistí, že výsledky testu jsou zjevně v rozporu s klinickými projevy, doporučuje se provést komplexní analýzu celého odkazu testu (odběr vzorků, cirkulace a odkazy na zpracování), aby se vyloučila časná infekce virem SARS-CoV-2, recidivující infekce nebo možná kombinace s jinými respiračními virovými infekcemi atd.Pokud to podmínky dovolí, doporučuje se odebrat citlivější vzorky, jako je sputum nebo tekutina z alveolární laváže, pro opětovné vyšetření.

Související produkty:

Sada detekce nukleových kyselin SARS-CoV-2 (metoda fluorescenční sondy Multiplex PCR)