一、Zvýšení citlivosti reakčního systému：

1. Izolujte vysoce kvalitní RNA:

Úspěšná syntéza cDNA pochází z vysoce kvalitní RNA.Vysoce kvalitní RNA by měla být alespoň plná a bez inhibitorů reverzní transkriptázy, jako je EDTA nebo SDS.Kvalita RNA určuje maximální množství sekvenčních informací, které můžete přepsat do cDNA.Běžnou metodou purifikace RNA je jednokroková metoda využívající guanidinisothiokyanát/kyselý fenol.Aby se zabránilo kontaminaci stopovým množstvím RNázy, je třeba RNA izolovanou ze vzorků bohatých na RNázu (jako je pankreas) skladovat ve formaldehydu, aby se zachovala vysoce kvalitní RNA, zejména pro dlouhodobé skladování.RNA extrahovaná z potkaních jater byla v podstatě degradována po skladování ve vodě po dobu jednoho týdne, zatímco RNA extrahovaná z potkaní sleziny zůstala stabilní po skladování ve vodě po dobu 3 let.Kromě toho jsou transkripty delší než 4 kb citlivější na degradaci stopovými RNázami než malé transkripty.Pro zvýšení stability skladovaných vzorků RNA lze RNA rozpustit v deionizovaném formamidu a skladovat při -70 °C.Formamid používaný k uchování RNA nesmí obsahovat zbytky degradující RNA.RNA z pankreatu může být zachována ve formamidu po dobu alespoň jednoho roku.Při přípravě k použití RNA můžete k vysrážení RNA použít následující metodu: přidejte NaCl do 0,2 M a 4násobku objemu ethanolu, umístěte na 3-5 minut při pokojové teplotě a 5 minut odstřeďujte při 10 000×g.

2. Použijte RNaseH-inaktivní (RNaseH-) reverzní transkriptázu：

Inhibitory RNázy se často přidávají k reverzním transkripčním reakcím, aby se zvýšila délka a výtěžek syntézy cDNA.Inhibitory RNázy by měly být přidány během reakce syntézy prvního vlákna v přítomnosti pufru a redukčního činidla (jako je DTT), protože proces před syntézou cDNA denaturuje inhibitor, čímž se uvolní navázaná RNáza, která může degradovat RNA.Inhibitory proteinové RNázy zabraňují pouze degradaci RNA RNázou A, B, C a nezabraňují RNáze na kůži, proto dávejte pozor, abyste si přes použití těchto inhibitorů nevnesli RNázu z prstů.

Reverzní transkriptáza katalyzuje konverzi RNA na cDNA.Jak M-MLV, tak AMV mají kromě své vlastní polymerázové aktivity endogenní aktivitu RNázyH.Aktivita RNázyH a aktivita polymerázy spolu soutěží o hybridní řetězec vytvořený mezi RNA templátem a primerem DNA nebo prodlužovacím řetězcem cDNA a degradují řetězec RNA v komplexu RNA:DNA.Templát RNA degradovaný aktivitou RNázyH již nemůže sloužit jako účinný substrát pro syntézu cDNA, což snižuje výtěžek a délku syntézy cDNA.Proto by bylo výhodné eliminovat nebo výrazně snížit aktivitu RNázyH reverzní transkriptázy.

Reverzní transkriptáza SuperScript Ⅱ, reverzní transkriptáza RNaseH-MMLV a reverzní transkriptáza thermoScript, RNázaH-AMV, mohou získat větší množství a více cDNA plné délky než MMLV a AMV.Citlivost RT-PCR bude ovlivněna množstvím syntézy cDNA.ThermoScript je mnohem citlivější než AMV.Velikost produktů RT-PCR je omezena schopností reverzní transkriptázy syntetizovat cDNA, zejména při klonování větších cDNA.Ve srovnání s MMLV SuperScripⅡ významně zvýšil výtěžnost dlouhých RT-PCR produktů.RNaseH-reverzní transkriptáza má také zvýšenou termostabilitu, takže reakce může být prováděna při teplotách vyšších než je normálních 37-42°C.Za navrhovaných podmínek syntézy použijte oligo(dT) primer a 10 μCi [a-P]dCTP.Celkový výtěžek prvního vlákna byl vypočten pomocí TCA precipitační metody.cDNA plné délky byla analyzována za použití pásů tříděných podle velikosti, které byly vyříznuty a spočítány na alkalickém agarózovém gelu.

3. Zvyšte inkubační teplotu pro reverzní transkripci:

Vyšší inkubační teplota pomáhá otevřít sekundární strukturu RNA, čímž se zvyšuje výtěžek reakce.U většiny templátů RNA inkubace RNA a primerů při 65 °C bez pufru nebo soli s následným rychlým ochlazením na ledu odstraní většinu sekundárních struktur a umožní navázání primerů.Některé šablony však stále mají sekundární struktury, a to i po tepelné denaturaci.Amplifikace těchto obtížných templátů může být provedena pomocí ThermoScript reverzní transkriptázy a umístěním reverzní transkripční reakce při vyšší teplotě pro zlepšení amplifikace.Vyšší inkubační teploty mohou také zvýšit specificitu, zvláště když se pro syntézu cDNA používají genově specifické primery (GSP) (viz kapitola 3).Pokud používáte GSP, zajistěte, aby Tm primerů byla stejná jako očekávaná inkubační teplota.Nepoužívejte oligo(dT) a náhodné primery nad 60 °C.Náhodné primery vyžadují inkubaci při 25 °C po dobu 10 minut před zvýšením na 60 °C.Kromě použití vyšší teploty reverzní transkripce lze specifičnost zlepšit také přímým převedením směsi RNA/primer z denaturační teploty 65 °C na teplotu inkubace reverzní transkripce a přidáním předehřáté 2× reakční směsi (syntéza cDNA hot-start).Tento přístup pomáhá předcházet mezimolekulárnímu párování bází, ke kterému dochází při nižších teplotách.Vícenásobné teplotní přepínání požadované pro RT-PCR lze zjednodušit použitím termocykleru.

Tth termostabilní polymeráza působí jako DNA polymeráza v přítomnosti Mg2+ a jako RNA polymeráza v přítomnosti Mn2+.Může být udržován v teple při maximální teplotě 65 °C.Přítomnost Mn2+ během PCR však snižuje věrnost, což činí Tth polymerázu méně vhodnou pro vysoce přesnou amplifikaci, jako je klonování cDNA.Kromě toho má Tth nízkou účinnost reverzní transkripce, což snižuje citlivost, a protože reverzní transkripci a PCR lze provádět s jediným enzymem, nelze kontrolní reakce bez reverzní transkripce použít k porovnání produktů amplifikace cDNA s kontaminující genomickou DNA.Produkty amplifikace byly odděleny.

4. Aditiva, která podporují reverzní transkripci:

Do syntézy prvního vlákna se přidávají aditiva včetně glycerolu a DMSO, což může snížit stabilitu dvouvlákna nukleové kyseliny a uvolnit sekundární strukturu RNA.Bez ovlivnění aktivity SuperScript II nebo MMLV lze přidat až 20 % glycerolu nebo 10 % DMSO.AMV může také tolerovat až 20 % glycerolu bez ztráty aktivity.Aby se maximalizovala citlivost RT-PCR v reakci reverzní transkripce SuperScriptⅡ, lze přidat 10% glycerol a inkubovat při 45 °C.Pokud se k PCR přidá 1/10 reakčního produktu reverzní transkripce, pak je koncentrace glycerolu v amplifikační reakci 0,4 %, což nestačí k inhibici PCR.

5. Léčba RNaseH:

Ošetření reakcí syntézy cDNA pomocí RNázyH před PCR může zvýšit citlivost.U některých templátů se předpokládá, že RNA v reakci syntézy cDNA brání vazbě amplifikačních produktů, v takovém případě může ošetření RNázouH zvýšit citlivost.Obecně je léčba RNázouH nezbytná při amplifikaci delších cílových templátů cDNA s plnou délkou, jako je low-copy tuberózní scheróza II.U tohoto obtížného templátu ošetření RNaseH zesílilo signál produkovaný SuperScript II nebo AMV-syntetizovanou cDNA.Pro většinu reakcí RT-PCR je ošetření RNázouH volitelné, protože krok denaturace PCR při 95 °C obecně hydrolyzuje RNA v komplexu RNA:DNA.

6. Zlepšení metody detekce malé RNA:

RT-PCR je obzvláště náročná, když jsou dostupná pouze malá množství RNA.Glykogen přidaný jako nosič během izolace RNA pomáhá zvýšit výtěžnost malých vzorků.Glykogen bez RNázy lze přidat současně s přidáním Trizolu.Glykogen je rozpustný ve vodě a může být udržován ve vodné fázi s RNA, aby se napomohlo následnému vysrážení.Pro vzorky menší než 50 mg tkáně nebo 106 kultivovaných buněk je doporučená koncentrace glykogenu bez RNázy 250 μg/ml.

Přidání acetylovaného BSA k reakci reverzní transkripce pomocí SuperScript II může zvýšit citlivost a pro malá množství RNA snížení množství SuperScript II a přidání 40 jednotek inhibitoru nukleázy RNaseOut může zvýšit úroveň detekce.Pokud je v procesu izolace RNA použit glykogen, stále se doporučuje přidat inhibitor BSA nebo RNázy, když používáte SuperScript II pro reakci reverzní transkripce.

二、Zvyšte specificitu RT-PCR

1. CND Asyntéza:

Syntéza prvního vlákna cDNA může být zahájena pomocí tří různých metod, jejichž relativní specificita ovlivňuje množství a typ syntetizované cDNA.

Metoda náhodného primeru byla ze tří metod nejméně specifická.Primery nasedají na více místech v celém transkriptu a vytvářejí krátké cDNA s částečnou délkou.Tato metoda se často používá k získání 5'koncových sekvencí a k získání cDNA z RNA templátů s oblastmi sekundární struktury nebo s terminačními místy, která nemohou být replikována reverzní transkriptázou.Pro získání nejdelší cDNA je třeba empiricky stanovit poměr primerů k RNA v každém vzorku RNA.Počáteční koncentrace náhodných primerů se pohybovala od 50 do 250 ng na 20 μl reakce.Protože cDNA syntetizovaná z celkové RNA pomocí náhodných primerů je primárně ribozomální RNA, je jako templát obecně zvolena poly(A)+RNA.

Oligo(dT) primery jsou specifičtější než náhodné primery.Hybridizuje s poly(A) ocasem nacházejícím se na 3' konci většiny eukaryotických mRNA.Protože poly(A)+ RNA tvoří přibližně 1 % až 2 % celkové RNA, množství a složitost cDNA je mnohem menší než u náhodných primerů.Vzhledem ke své vysoké specificitě oligo(dT) obecně nevyžaduje optimalizaci poměru RNA k primerům a poly(A)+ selekci.Doporučuje se použít 0,5μg oligo(dT) na 20μl reakčního systému.oligo(dT)12-18 je vhodný pro většinu RT-PCR.Systém ThermoScript RT-PCR nabízí oligo(dT)20 kvůli jeho lepší tepelné stabilitě pro vyšší inkubační teploty.

Genově specifické primery (GSP) jsou nejspecifičtějšími primery pro krok reverzní transkripce.GSP je antisense oligonukleotid, který může specificky hybridizovat s cílovou sekvencí RNA, na rozdíl od náhodných primerů nebo oligo(dT), které nasedají na všechny RNA.Stejná pravidla používaná pro návrh PCR primerů platí pro návrh GSP v reakcích reverzní transkripce.GSP může být stejná sekvence jako amplifikační primer, který nasedá na 3'-nejvíce konec mRNA, nebo může být GSP navržen tak, aby nasedal po směru od reverzního amplifikačního primeru.Pro některé amplifikované subjekty musí být pro úspěšnou RT-PCR navržen více než jeden antisense primer, protože sekundární struktura cílové RNA může bránit navázání primeru.Doporučuje se použít 1 pmol antisense GSP v 20 μl reakci syntézy prvního vlákna.

2. Zvyšte inkubační teplotu pro reverzní transkripci:

Aby bylo možné plně využít všech výhod GSP specificity, měla by být použita reverzní transkriptáza s vyšší termostabilitou.Termostabilní reverzní transkriptázy mohou být inkubovány při vyšších teplotách, aby se zvýšila přísnost reakce.Například, jestliže GSP nasedá při 55 °C, specificita GSP nebude plně využita, pokud se pro reverzní transkripci použije AMV nebo M-MLV při nízké stringenci 37 °C.SuperScript II a ThermoScript však mohou reagovat při 50 °C nebo vyšších, což eliminuje nespecifické produkty generované při nižších teplotách.Pro maximální specificitu lze směs RNA/primer přenést přímo z teploty denaturace 65 °C na teplotu inkubace s reverzní transkripcí a přidat do předehřáté 2× reakční směsi (horký start syntézy cDNA).To pomáhá předcházet mezimolekulárnímu párování bází při nízkých teplotách.Vícenásobné teplotní přechody požadované pro RT-PCR lze zjednodušit použitím termocykleru.

3. Snižuje kontaminaci genomovou DNA：

Potenciálním problémem, se kterým se setkáváme u RT-PCR, je kontaminace genomové DNA v RNA.Použití dobré metody izolace RNA, jako je Trizol Reagent, sníží množství genomové DNA kontaminující přípravek RNA.Aby se předešlo produktům odvozeným z genomové DNA, může být RNA ošetřena DNázou I stupně amplifikace, aby se odstranila kontaminující DNA před reverzní transkripcí.Štěpení DNázou I bylo ukončeno inkubací vzorků v 2,0 mM EDTA po dobu 10 minut při 65 °C.EDTA může chelatovat ionty hořčíku, čímž zabraňuje hydrolýze RNA závislé na hořčíku při vysokých teplotách.

Aby bylo možné oddělit amplifikovanou cDNA od kontaminujících produktů amplifikace genomové DNA, mohou být navrženy primery, které každý nasedají k oddělení exonů.Produkty PCR odvozené z cDNA budou kratší než produkty odvozené z kontaminované genomové DNA.Kromě toho byl na každém templátu RNA proveden kontrolní experiment bez reverzní transkripce, aby se určilo, zda daný fragment pochází z genomové DNA nebo cDNA.Produkt PCR získaný bez reverzní transkripce pochází z genomu.