Přehled
Rychlá identifikace transgenních rostlin
Text/Tong Yucheng
Experimentální provoz/Han Ying
Redaktor/Wen Youjun
Slov/1600+
Doporučená doba čtení/8-10 minut
Rychlá identifikace transgenních rostlin
Jako nováček v laboratoři není dobré oddělit pozitivní rostliny ze skupiny rostlin s nízkou mírou konverze.Nejprve je nutné extrahovat DNA z velkého počtu vzorků jeden po druhém a poté budou cizí geny detekovány pomocí PCR.Výsledky jsou však často prázdné a občasné proužky s několika položkami, ale není možné určit, zda došlo k chybným detekcím nebo chybným detekcím..Je velmi bezmocné čelit takovému experimentálnímu procesu a výsledkům?Nebojte se, bratr vás naučí, jak snadno a přesně vyřadit transgenní pozitivní rostliny.
Krok 1: Navrhněte detekční primery
Určete endogenní gen a exogenní gen, které mají být detekovány, podle vzorku, který má být testován, a vyberte reprezentativní sekvenci 100-500 bp v genu pro návrh primeru.Dobré primery mohou zajistit přesnost výsledků detekce a zkrátit dobu detekce (běžně používané detekční primery viz příloha).
Poznámka:
Nově navržené primery potřebují optimalizovat reakční podmínky a ověřit přesnost, přesnost a detekční limit detekce před provedením detekce ve velkém měřítku.
Krok 2:Vypracujte experimentální protokol
Pozitivní kontrola: Použijte purifikovanou DNA obsahující cílový fragment jako templát k určení, zda jsou reakční systém a podmínky PCR normální.
Negativní/slepá kontrola: Použijte templát DNA nebo ddH2O, která neobsahuje cílový fragment jako templát pro detekci, zda je v systému PCR zdroj kontaminace.
Interní referenční kontrola: použijte kombinaci primer/sonda endogenního genu vzorku, který má být testován, k vyhodnocení, zda lze templát detekovat pomocí PCR.
Poznámka:
Pro každý test by měly být nastaveny pozitivní, negativní/slepé kontroly a kontroly vnitřní kontroly, aby se vyhodnotila platnost experimentálních výsledků.
Krok 3: Příprava experimentu
Před použitím sledujte, zda je roztok rovnoměrně promíchán.Pokud se objeví sraženina, je potřeba ji před použitím rozpustit a promíchat podle návodu.2×PCR směs je třeba před použitím napipetovat a opakovaně promíchat mikropipetou, aby se zabránilo nerovnoměrné distribuci iontů.
Poznámka:
Vyjměte pokyny a pečlivě si je přečtěte a před experimentem se připravte přesně v souladu s pokyny.
Krok 4: Připravte PCR reakční systém
Podle experimentálního protokolu smíchejte primery, H2O, 2×PCR promíchejte, odstřeďte a rozdělte do každé reakční zkumavky.
Poznámka:
Pro rozsáhlé nebo dlouhodobé testování se doporučuje použít reakční systém PCR obsahující enzym UNG, který dokáže účinně zabránit kontaminaci aerosolu způsobenému produkty PCR.
Krok 5: Přidejte reakční šablonu
Při použití technologie Direct PCR není potřeba zdlouhavý proces čištění nukleových kyselin.Templát vzorku lze připravit během 10 minut a přidat do odpovídajícího reakčního systému PCR.
Poznámka:
Metoda Lysis má lepší detekční účinek a získaný produkt lze použít pro více detekčních reakcí.
5.1: Přímá PCR listů
Podle velikosti obrázku v návodu odřízněte pletivo listu o průměru 2-3mm a vložte do reakčního systému PCR.
Poznámka: Ujistěte se, že fragmenty listů jsou zcela ponořeny v reakčním roztoku PCR a nepřidávejte nadměrné množství tkáně listů.
5.2: Metoda lýzy listů
Odřízněte listovou tkáň o průměru 5-7 mm a vložte ji do centrifugační zkumavky.Pokud zvolíte zralé listy, vyhněte se prosím použití pletiv hlavní žíly listu.Napipetujte 50 ul lyzátu pufru P1 do centrifugační zkumavky, abyste zajistili, že lyzát může zcela ponořit listovou tkáň, umístěte jej do termocykléru nebo kovové lázně a lyzujte při 95 °C po dobu 5-10 minut.
Přidejte 50 ul neutralizačního roztoku pufru P2 a dobře promíchejte.Výsledný lyzát lze použít jako templát a přidat do reakčního systému PCR.
Poznámka: Množství templátu by mělo být mezi 5–10 % systému PCR a nemělo by překročit 20 % (například v systému 20 μl PCR přidejte 1–2 μl lyzačního pufru, ne více než 4 μl).
Krok 6: Reakce PCR
Po odstředění PCR reakční zkumavky je umístěte do PCR přístroje pro amplifikaci.
Poznámka:
Reakce využívá k amplifikaci nepurifikovaný templát, takže počet cyklů amplifikace je o 5-10 cyklů více než při použití purifikovaného templátu DNA.
Krok 7: Detekce elektroforézy a analýza výsledků
M:100bp DNA žebřík
1\4: Metoda purifikované DNA
2\5: Přímá metoda PCR
3\6: Prázdný ovládací prvek
Kontrola kvality:
Výsledky testů různých kontrol nastavených v experimentu by měly splňovat následující podmínky.V opačném případě by měla být analyzována příčina problému a po odstranění problému by měl být test proveden znovu.
Tabulka 1. Normální výsledky testů různých kontrolních skupin
*Pokud je plazmid použit jako pozitivní kontrola, výsledek testu endogenního genu může být negativní
Výsledek rozsudku:
A. Výsledek testu endogenního genu vzorku je negativní, což naznačuje, že DNA vhodnou pro běžnou PCR detekci nelze ze vzorku extrahovat nebo extrahovaná DNA obsahuje inhibitory PCR reakce a DNA by měla být extrahována znovu.
B. Výsledek testu endogenního genu vzorku je pozitivní a výsledek testu exogenního genu je negativní, což ukazuje, že DNA vhodná pro běžnou PCR detekci je extrahována ze vzorku a lze usoudit, že gen XXX není ve vzorku detekován.
C. Výsledek testu endogenního genu vzorku je pozitivní a výsledek testu exogenního genu je pozitivní, což ukazuje, že DNA vhodná pro běžnou PCR detekci byla extrahována ze vzorku a DNA vzorku obsahuje gen XXX.Potvrzovací experimenty mohou být dále prováděny.
Krok 8: Navrhněte detekční primery
Po experimentu použijte 2% roztok chlornanu sodného a 70% roztok etanolu k očištění experimentální plochy, abyste zabránili znečištění životního prostředí.
slepé střevo
Tabulka 2. Běžně používané primery pro obecnou PCR detekci geneticky modifikovaných rostlin
Referenční dokument:
SN/T 1202-2010, Kvalitativní PCR detekční metoda pro geneticky modifikované rostlinné složky v potravinách.
Oznámení Ministerstva zemědělství 1485-5-2010, Testování složek geneticky modifikovaných rostlin a produktů z nich - rýže M12 a jejích derivátů.
Čas odeslání: 09.06.2021
