COVID-19 je infekční onemocnění způsobené těžkým akutním respiračním syndromem Coronavirus typu 2. Když je člověk infikován, mezi nejčastější příznaky patří horečka, kašel a dušnost.

Vzorky použité pro testování mohou být odebrány výtěry z nosohltanu nebo orofaryngeálními výtěry.

Co je to PCR?

Standardní metodou detekce koronaviru je polymerázová řetězová reakce, PCR.Jedná se o metodu široce používanou v molekulární biologii.Dokáže rychle zkopírovat miliony až miliardy specifických fragmentů DNA.

Nový koronavirus obsahuje velmi dlouhý jednovláknový RNA genom.Aby bylo možné tyto viry detekovat pomocí PCR, musí být molekuly RNA převedeny na jejich komplementární sekvence DNA pomocí reverzní transkriptázy a poté může být nově syntetizovaná DNA amplifikována standardními postupy PCR, které jsou běžně známé jako RT-PCR.

RT-PCR proces

Extrakce RNA

K provedení této metody by měla být v podstatě extrahována virová RNA.Pro pohodlnou, rychlou a účinnou separaci lze použít různé soupravy pro čištění RNA.

Pro extrakci virové RNA pomocí komerční sady nejprve přidejte vzorek do mikrocentrifugační zkumavky a poté jej smíchejte s lyzačním pufrem.Tento pufr je vysoce denaturovaný a obvykle sestává z fenolu a guanidin isothiokyanátu.Kromě toho jsou v lyzačním pufru obvykle přítomny inhibitory RNázy, aby se zajistila izolace intaktní virové RNA.

Po přidání lyzačního pufru pulzně promíchejte míchací zkumavku a inkubujte při pokojové teplotě.Virus je poté lyžován za vysoce denaturačních podmínek poskytovaných lyzačním pufrem.

Po lýze vzorku se k purifikačnímu postupu použije centrifugační zkumavka.Vzorek se vloží do centrifugační zkumavky a poté se odstředí.

Tento postup je metodou extrakce pevnou fází, ve které se stacionární fáze skládá ze silikagelové matrice.

Za optimálních podmínek soli a pH se molekuly RNA vážou na membránu oxidu křemičitého.

Současně jsou odstraněny bílkoviny a další nečistoty.

Po centrifugaci vložte centrifugační zkumavku do čisté sběrné zkumavky, filtrát zlikvidujte a poté přidejte promývací pufr.

Znovu vložte zkumavku do centrifugy, aby se promývací pufr protlačil přes membránu.Tím se odstraní všechny zbývající nečistoty z membrány a zůstane pouze RNA navázaná na silikagelu.

Po promytí vzorku vložte zkumavku do čisté mikrocentrifugační zkumavky a přidejte eluční pufr.

Poté se odstředí, aby se eluční pufr protlačil membránou.Eluční pufr odstraňuje virovou RNA z kolony a získává purifikovanou RNA bez proteinů, inhibitorů a dalších kontaminantů.

KROK 2

Směsný koncentrát

Po extrakci virové RNA je dalším krokem příprava reakční směsi pro PCR amplifikaci.V tomto kroku se používá koncentrát.Tento koncentrovaný roztok je předem smíchaný koncentrovaný roztok sestávající z premixu, reverzní transkriptázy, nukleotidů, dopředného primeru, reverzního primeru, sondy TaqMan a DNA polymerázy.

Nakonec, k dokončení této reakční směsi, se přidá templát RNA.Zkumavky se promíchají pulzním vortexováním a poté se reakční směs nanese na PCR destičku.PCR destička obvykle obsahuje 96 jamek a může analyzovat více vzorků současně.

KROK 3

PCR amplifikace

Dále umístěte destičku do přístroje PCR, což je v podstatě termocykler.

RT-PCR v reálném čase se používá k detekci nového koronaviru 2019 amplifikací cílové sekvence v genu RdrRP, genu E a genu N.Výběr cílového genu závisí na sekvenci primeru a sondy.

Prvním krokem RT-PCR je reverzní transkripce.Je syntetizováno první vlákno komplementární DNA, které je iniciováno PCR reverzním primerem, který se váže na komplementární část genomu virové RNA.Poté reverzní transkriptáza přidá nukleotidy DNA na 3'konec primeru, aby se syntetizovala DNA komplementární k virové RNA.Teplota a trvání tohoto kroku závisí na použitých primerech, cílové RNA a reverzní transkriptáze.

Dále je aplikován počáteční denaturační krok, jehož výsledkem je denaturace hybridu RNA-DNA.Tento krok je nezbytný pro aktivaci DNA polymerázy.Současně je inaktivována reverzní transkriptáza.

PCR se skládá ze série tepelných cyklů.Každý cyklus se skládá z kroků denaturace, žíhání a prodloužení.

Denaturační krok zahrnuje zahřátí reakční komory na 95 stupňů Celsia a její použití pro denaturaci templátu dvouvláknové DNA.

V dalším kroku se reakční teplota sníží na 58 stupňů Celsia, což umožní přímému primeru nasednout na komplementární část jeho jednovláknového DNA templátu.Teplota žíhání přímo závisí na délce a složení primeru.

V prodlužovacím kroku DNA polymeráza syntetizuje nový řetězec DNA, který je komplementární k řetězci templátu DNA.Přidáním volných jader komplementárních k templátu ve směru 5′ až 3′ od reakční směsi.Teplota tohoto kroku závisí na použité DNA polymeráze.

Po prvním cyklu se získá cíl dvouvláknové DNA.

Poté zadejte druhý cyklus.Dvouřetězcová DNA je denaturována za vzniku dvou jednořetězcových molekul DNA.

V dalším kroku se reakční teplota sníží, primery se nasednou na každý templát jednořetězcové DNA a sonda Taq-man se nasedá na komplementární část cílové DNA.

Sonda TaqMan se skládá z fluoroforu kovalentně spojeného s 5' koncem oligonukleotidové sondy.Při excitaci světelným zdrojem cykléru fluorofor emituje fluorescenci.Kromě toho je sonda složena z tlumiče na 3′konci.Blízkost reportérového genu ke zhášeči brání detekci fluorescence.

V prodlužovacím kroku DNA polymeráza syntetizuje nový řetězec.Když polymeráza dosáhne sondy TaqMan, její endogenní 5'nukleázová aktivita štěpí sondu a oddělí barvivo od zhášeče.

S každým cyklem PCR se uvolňuje více molekul barviva, což má za následek zvýšení intenzity fluorescence úměrné počtu syntetizovaných amplikonů.

Tato metoda umožňuje odhadnout počet dané sekvence přítomné ve vzorku.Počet fragmentů dvouvláknové DNA se v každém cyklu zdvojnásobí.Proto lze PCR použít k analýze velmi malých vzorků.

Pro měření fluorescenčního signálu, wolframové halogenové žárovky, excitačního filtru, reflektoru, čočky, emisního filtru a nábojově vázaného zařízení použijte CCD kameru.

KROK 4 Detekce

Pro měření fluorescenčního signálu, wolframové halogenové žárovky, excitačního filtru, reflektoru, čočky, emisního filtru a nábojově vázaného zařízení použijte CCD kameru.

Filtrované světlo z lampy se odráží od reflektoru, prochází kondenzorovou čočkou a je zaostřeno do středu každého otvoru.Poté se fluorescence vyzařovaná z otvoru odráží od zrcadla, prochází emisním filtrem a je detekována CCD kamerou.V každém cyklu PCR může být pomocí CCD detekováno samobuzené světlo fluoroforu.

Převádí zachycené světlo na digitální data.Tato metoda se nazývá real-time PCR a umožňuje sledování průběhu PCR reakce v reálném čase.