Několik revolučních vynálezů v historii detekční technologie v mé mysli je technologie imunoznačení založená na principu specifické vazby antigen-protilátka, technologie PCR a technologie sekvenování.Dnes budeme hovořit o technologii PCR.Podle vývoje technologie PCR lidé obvykle rozdělují technologii PCR do tří generací: běžnou technologii PCR, technologii fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase a digitální technologii PCR.
Cběžná technika PCR
KARY MULLIS (1944.12.28-2019.8.7)
Kary Mullis vynalezl polymerázovou řetězovou reakci (polymerázová řetězová reakce, PCR) v roce 1983. Říká se, že když řídil svou přítelkyni, náhle ho inspirovalo a přemýšlel o principu PCR (o výhodách řízení).Kary Mullis získala Nobelovu cenu za chemii v roce 1993. The New York Times to komentoval slovy: „Vysoce originální a významné, téměř rozdělující biologii na období před PCR a po PCR.
Princip PCR: Za katalýzy DNA polymerázy se jako templát použije mateřský řetězec DNA a jako výchozí bod extenze se použije specifický primer a in vitro se pomocí denaturace, nasedání, extenze a dalších kroků zkopíruje DNA dceřiného řetězce komplementární k templátové DNA mateřského řetězce.Jedná se o technologii amplifikace syntézy DNA in vitro, která dokáže rychle a specificky amplifikovat jakoukoli cílovou DNA in vitro.
Výhody běžné PCR
1.Klasická metoda, kompletní mezinárodní i domácí standardy
2.Nižší cena přístrojových činidel
3.Produkty PCR lze získat pro jiné experimenty molekulární biologie
Doporučený přístroj Foregene PCR: https://www.foreivd.com/foreamp-sn-695-series-thermal-cycler-96-wells-pcr-machine-product/
Související produkty: https://www.foreivd.com/pcr-herotm-with-dye-product/
Nevýhody běžné PCR
1.snadno se znečistí
2.těžkopádná operace
3.pouze kvalitativní analýza
4.Střední citlivost
5.Dochází k nespecifické amplifikaci, a když je nespecifické pásmo stejné velikosti jako cílové pásmo, nelze jej rozlišit
CPCR na bázi apilární elektroforézy
V reakci na nedostatky běžné PCR zavedli někteří výrobci přístroje založené na principu kapilární elektroforézy.Krok elektroforézy po PCR amplifikaci je dokončen v kapiláře.Citlivost je vyšší a lze rozlišit rozdíl několika bází a pomocí MAERKER vypočítat zesílení.obsah produktu.Nevýhodou je, že PCR produkt je stále potřeba otevřít a vložit do přístroje a stále existuje velké riziko kontaminace.
CapilárEelektroforéza
2. Technologie fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase (Quantitative Real-time PCR, qPCR)Fluorescenční kvantitativní PCR, také nazývaná Real-Time PCR, je nová kvantitativní technologie nukleových kyselin vyvinutá PE (Perkin Elmer) v roce 1995. Historie vývoje fluorescenční kvantitativní PCR je historií duší vzrušujících bojů gigantů, jako jsou ABI, Roche a Bio-Rad.Pokud máte zájem, můžete se na to podívat.Tato technika je v současnosti nejvyspělejší a široce používanou semikvantitativní PCR technikou.
Doporučený stroj qPCR: https://www.foreivd.com/mini-real-time-pcr-system-forequant-sf2sf4-product/
Metoda fluorescenčního barviva (SYBR Green I):SYBR Green I je nejčastěji používané barvivo vázající DNA pro kvantitativní PCR, které se nespecificky váže na dvouvláknovou DNA.Ve volném stavu SYBR Green emituje slabou fluorescenci, ale jakmile se naváže na dvouvláknovou DNA, její fluorescence se zvýší 1000krát.Proto je celkový fluorescenční signál emitovaný reakcí úměrný množství přítomné dvouvláknové DNA a bude se zvyšovat s nárůstem amplifikovaného produktu.Protože se barvivo nespecificky váže na dvouvláknovou DNA, mohou být generovány falešně pozitivní výsledky.
Související produkty: https://www.foreivd.com/real-time-pcr-easytm-sybr-green-i-kit-product/
Metoda fluorescenční sondy (technologie Taqman): BěhemPCR amplifikace, specifická fluorescenční sonda je přidána současně s párem primerů.Sonda je lineární oligonukleotid s fluorescenční reportérovou skupinou a fluorescenční zhášecí skupinou na obou koncích.Když je sonda intaktní, fluorescenční signál emitovaný reportérovou skupinou je absorbován zhášecí skupinou a detekce Neexistuje žádný fluorescenční signál;během PCR amplifikace (ve fázi extenze) bude 5'-3' Dicer aktivita enzymu Taq štěpit a degradovat sondu, takže reportérová fluorescenční skupina a zhášecí fluorescenční skupina jsou odděleny, takže systém monitorování fluorescence Fluorescenční signál může být přijímán, to znamená, že pokaždé, když se zesílí řetězec DNA, vytvoří se fluorescenční molekula, která realizuje kompletní tvorbu synchronizace fluorescenčních signálů PCRMetoda sondy Taqman je nejběžněji používanou detekční metodou v klinické detekci.
Související produkty: https://www.foreivd.com/quickeasy%e1%b5%80%e1%b4%b9-real-time-pcr-kit-taqman-product/
Výhody qPCR
1.Metoda je vyzrálá a podpůrné vybavení a činidla jsou kompletní
2.Střední cena činidel
3.snadné použití
4.Vysoká citlivost a specificita detekce
Nevýhody qPCR
Mutace cílového genu vede k chybné detekci.
Výsledek detekce templátu s nízkou koncentrací nelze určit.
Při použití standardní křivky pro kvantitativní detekci dochází k velké chybě.
3. Technologie digitální PCR (digital PCR, dPCR).
Digitální PCR je technika pro absolutní kvantifikaci molekul nukleové kyseliny.Ve srovnání s qPCR dokáže digitální PCR přímo číst počet molekul DNA/RNA, což je absolutní kvantifikace molekul nukleové kyseliny ve výchozím vzorku.V roce 1999 Bert Vogelstein a Kenneth W. Kin-zler formálně navrhli koncept dPCR.
V roce 2006 byla společnost Fluidigm první, kdo vyrobil komerční nástroj dPCR založený na čipu.V roce 2009 společnost Life Technologies uvedla na trh systémy OpenArray a QuantStudio 12K Flex dPCR.V roce 2013 společnost Life Technologies uvedla na trh systém QuantStudio 3DdPCR, který využívá technologii mikrofluidních čipů s vysokou hustotou nanoměřítek k rovnoměrné distribuci vzorků do 20 000 jednotlivých buněk.v reakční dobře.
V roce 2011 uvedla společnost Bio-Rad na trh kapkový přístroj QX100 dPCR, který využívá technologii voda v oleji k rovnoměrné distribuci vzorku do 20 000 kapek vody v oleji a k analýze kapiček používá analyzátor kapek.V roce 2012 uvedla společnost RainDance na trh nástroj RainDrop dPCR, poháněný vysokotlakým plynem, aby rozdělil každý standardní reakční systém na reakční emulzi obsahující 1 milion až 10 milionů mikrokapiček na úrovni pikolitru.
Digitální PCR zatím vytvořila dvě hlavní frakce, typ čipu a typ kapky.Bez ohledu na to, jaký druh digitální PCR, její základní principy jsou limitující ředění, koncová PCR a Poissonova distribuce.Standardní PCR reakční systém obsahující templáty nukleových kyselin je rovnoměrně rozdělen do desítek tisíc PCR reakcí, které jsou distribuovány na čipy nebo mikrokapky tak, aby každá reakce obsahovala co nejvíce templátové molekuly, a je provedena jednomolekulární templátová PCR reakce.Odečtením fluorescence Přítomnost nebo nepřítomnost signálu se spočítá a absolutní kvantifikace se provede po kalibraci statistického Poissonova rozdělení.
Níže jsou uvedeny charakteristiky několika digitálních platforem PCR, které jsem použil:
1. Bio-Rad QX200 kapičková digitální PCR Bio-RadQX200 je velmi klasická digitální platforma PCR, základní proces detekce: 20 000 vzorků vygeneruje generátor kapiček Mikrokapky typu voda v oleji jsou amplifikovány na běžném PCR stroji a nakonec fluorescenční signál každé mikrokapky je přečten čtečkou mikrokapek.Obsluha je složitější a riziko znečištění střední.
Digitální PCR s mikrokapkami Xinyi TD1Xinyi TD1 je domácí digitální platforma PCR, základní detekční proces: generujte 30 000-50 000 kapiček vody v oleji pomocí generátoru kapiček, amplifikujte na běžném přístroji PCR a nakonec projděte Čtečka kapiček čte fluorescenční signál každé kapky.Generování kapiček i čtení na této platformě jsou prováděny ve vyhrazeném čipu s nízkým rizikem kontaminace.
STILLA Naica mikrokapkový čip digitální PCRSTILLA Naica je relativně nová digitální platforma PCR.Základní detekční proces je: přidat reakční roztok do čipu, vložit čip do systému generování a zesilování mikrokapiček a vygenerovat 30 000 mikrokapiček.Naneste na čip a PCR amplifikace je dokončena na čipu.Poté se zesílený čip přenese do systému pro analýzu mikrokapiček a fluorescenční signál se přečte pořízením snímků.Protože celý proces probíhá v uzavřeném čipu, je riziko kontaminace nízké.
4. Digitální PCR čip ThermoFisher QuantStudio 3D
ThermoFisher QuantStudio 3D je další klasická čipová digitální platforma PCR.Jeho základní detekční proces je: přidat reakční roztok do roznášeče a reakční roztok rovnoměrně rozprostřít na čip s 20 000 mikrojamkami přes roznášedlo., vložte čip do přístroje PCR, aby se zesílil, a nakonec vložte čip do čtečky a pořiďte fotografii pro čtení fluorescenčního signálu.Operace je poměrně komplikovaná a celý proces probíhá v uzavřeném čipu a riziko kontaminace je nízké.
5. Digitální PCR čip JN MEDSYS Clarity
JN MEDSYS Clarity je relativně nová digitální PCR platforma čipového typu.Jeho základní detekční proces je: přidat reakční roztok do aplikátoru a reakční roztok rovnoměrně nanést na 10 000 PCR zkumavek upevněných v PCR zkumavce přes aplikátor.Na mikroporézním čipu vstupuje reakční roztok do čipu kapilárním působením a PCR zkumavka s čipem je umístěna na PCR stroj pro amplifikaci a nakonec je čip vložen do čtečky, aby se pořídil snímek fluorescenčního signálu.Operace je složitější.Riziko kontaminace je nízké.
Parametry každé digitální platformy PCR jsou shrnuty takto:
Hodnotícími indikátory digitální PCR platformy jsou: počet rozdělených jednotek, počet fluorescenčních kanálů, složitost provozu a riziko kontaminace.Nejdůležitější je ale přesnost detekce.Jedním ze způsobů hodnocení digitálních platforem PCR je použití více digitálních platforem PCR k vzájemnému ověření a dalším způsobem je použití standardních látek s přesnými hodnotami.
Výhody dPCR
1.Dosažení absolutní kvantifikace
2.Vyšší citlivost a specificita
3.Dokáže detekovat vzorky s nízkým počtem kopií
Nevýhody dPCR1. Drahé vybavení a činidla 2. Složitá operace a dlouhá doba detekce 3. Úzký rozsah detekce
V současné době mají tři generace technologie PCR své výhody a nevýhody a každá má své vlastní aplikační oblasti a nejde o vztah, že jedna generace nahrazuje druhou.Neustálý pokrok technologie vnesl do technologie PCR novou vitalitu, která jí umožňuje odemykat jeden směr aplikace za druhým, takže detekce nukleových kyselin je pohodlnější a přesnější.
Zdroj: Dr. Yuan vás vezme na testování
Doporučené produkty:
Čas odeslání: 18. listopadu 2022
