• Facebook
  • linkedin
  • Youtube

Technologie molekulární diagnostiky využívá metody molekulární biologie k detekci exprese a struktury genetického materiálu lidského těla a různých patogenů, aby bylo dosaženo účelu predikce a diagnostiky onemocnění.

V posledních letech, s modernizací a iterací molekulární diagnostické technologie, se klinická aplikace molekulární diagnostiky stala stále rozsáhlejší a hlubší a trh molekulární diagnostiky vstoupil do období rychlého rozvoje.

Autor shrnuje běžné technologie molekulární diagnostiky na trhu a je rozdělen do tří částí: první část představuje technologii PCR, druhá část představuje technologii izotermické amplifikace nukleových kyselin a druhá část představuje technologii sekvenování.

01

Část I: Technologie PCR

PCR technologie

PCR (polymerázová řetězová reakce) je jednou z technologií in vitro amplifikace DNA s více než 30letou historií.

Technologie PCR byla průkopníkem v roce 1983 Kary Mullis z Cetus, USA.Mullis požádal o patent PCR v roce 1985 a ve stejném roce publikoval první akademickou práci PCR o vědě.Mullis získal Nobelovu cenu za chemii v roce 1993.

Základní principy PCR

PCR může amplifikovat fragmenty cílové DNA více než milionkrát.Princip spočívá v tom, že za katalýzy DNA polymerázy se jako templát použije rodičovský řetězec DNA a jako výchozí bod pro prodlužování se použije specifický primer.Replikuje se in vitro prostřednictvím kroků, jako je denaturace, žíhání a extenze.Proces dceřiného řetězce DNA komplementárního k mateřskému vláknu templátové DNA.

1

Standardní proces PCR je rozdělen do tří kroků:

1. Denaturace: Použijte vysokou teplotu k oddělení dvouřetězců DNA.Vodíkové vazby mezi dvojvlákny DNA se přerušují při vysokých teplotách (93-98°C).

2. Annealing: Po oddělení dvouřetězcové DNA se teplota sníží, aby se primer mohl vázat na jednořetězcovou DNA.

3. Extenze: DNA polymeráza začne syntetizovat komplementární řetězce podél řetězců DNA z primerů navázaných při snížení teploty.Když je prodloužení dokončeno, cyklus je dokončen a počet fragmentů DNA se zdvojnásobí.

Vrácením těchto tří kroků 25-35krát se počet fragmentů DNA exponenciálně zvýší.

2

Vynalézavost PCR spočívá v tom, že různé primery mohou být navrženy pro různé cílové geny, takže fragmenty cílových genů mohou být amplifikovány v krátkém časovém období.

Dosud lze PCR rozdělit do tří kategorií, a to běžnou PCR, fluorescenční kvantitativní PCR a digitální PCR.

První generace obyčejné PCR

K amplifikaci cílového genu použijte běžný PCR amplifikační přístroj a poté použijte elektroforézu na agarózovém gelu k detekci produktu, lze provést pouze kvalitativní analýzu.

Hlavní nevýhody první generace PCR:

-Sklon k nespecifické amplifikaci a falešně pozitivním výsledkům.

-Detekce trvá dlouho a operace je těžkopádná.

- Lze provést pouze kvalitativní testování.

Druhá generace fluorescenční kvantitativní PCR

Fluorescenční kvantitativní PCR (Real-Time PCR), také známá jako qPCR, se používá k monitorování akumulace amplifikovaných produktů prostřednictvím akumulace fluorescenčních signálů přidáním fluorescenčních sond, které mohou indikovat postup reakčního systému, a k posouzení výsledků pomocí fluorescenční křivky a lze ji kvantifikovat pomocí hodnoty Cq a standardní křivky.

Vzhledem k tomu, že technologie qPCR probíhá v uzavřeném systému, snižuje se pravděpodobnost kontaminace a fluorescenční signál lze sledovat pro kvantitativní detekci, takže je v klinické praxi nejpoužívanější a stala se dominantní technologií v PCR.

Fluorescenční látky používané ve fluorescenční kvantitativní PCR v reálném čase lze rozdělit na: fluorescenční sondy TaqMan, molekulární majáky a fluorescenční barviva.

1) Fluorescenční sonda TaqMan:

Během PCR amplifikace je přidána specifická fluorescenční sonda za současného přidávání páru primerů.Sonda je oligonukleotid a dva konce jsou příslušně označeny reportérovou fluorescenční skupinou a zhášecí fluorescenční skupinou.

Když je sonda intaktní, fluorescenční signál emitovaný reportérovou skupinou je absorbován zhášecí skupinou;během PCR amplifikace 5′-3′ exonukleázová aktivita enzymu Taq štěpí a degraduje sondu, čímž se reportérová fluorescenční skupina a zhášedlo Fluorescenční skupina oddělí, takže fluorescenční monitorovací systém může přijímat fluorescenční signál, to znamená pokaždé, když je amplifikován řetězec DNA, synchronizuje se s tvorbou fluorescenční molekuly, vytvoří se fluorescenční signál a produkt PCR je akumulací

2) Fluorescenční barviva SYBR:

V reakčním systému PCR se přidá nadbytek fluorescenčního barviva SYBR.Poté, co je fluorescenční barvivo SYBR nespecificky začleněno do dvouvlákna DNA, vyšle fluorescenční signál.Molekula barviva SYBR, která není začleněna do řetězce, nebude emitovat žádný fluorescenční signál, čímž zajistí fluorescenční signál. Nárůst produktů PCR je zcela synchronizován s nárůstem produktů PCR.SYBR se váže pouze na dvouvláknovou DNA, takže křivku tání lze použít k určení, zda je reakce PCR specifická.

3 4

3) Molekulární majáky

Jedná se o oligonukleotidovou sondu s dvojitou smyčkou, která tvoří vlásenkovou strukturu s přibližně 8 bázemi na 5 a 3 koncích.Sekvence nukleové kyseliny na obou koncích jsou komplementárně spárovány, což způsobuje, že fluorescenční skupina a zhášecí skupina jsou těsné.Zavřete, nebude produkovat fluorescenci.

5

Po vytvoření produktu PCR během procesu nasedání se střední část molekulárního majáku spáruje se specifickou sekvencí DNA a fluorescenční gen se oddělí od zhášecího genu, aby se vytvořila fluorescence.

6

Hlavní nevýhody PCR druhé generace:

Stále chybí citlivost a detekce vzorků s malým počtem kopií není přesná.

Existuje vliv hodnoty pozadí a výsledek je náchylný k rušení.

Digitální PCR třetí generace

Digitální PCR (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) vypočítává počet kopií cílové sekvence pomocí detekce koncového bodu a může provádět přesnou absolutní kvantitativní detekci bez použití vnitřních kontrol a standardních křivek.

Digitální PCR využívá detekci koncových bodů a nezávisí na hodnotě Ct (prahová hodnota cyklu), takže digitální PCR reakce je méně ovlivněna účinností amplifikace a je zlepšena tolerance k inhibitorům PCR reakce s vysokou přesností a reprodukovatelností.

Vzhledem k charakteristice vysoké citlivosti a vysoké přesnosti není snadno rušen inhibitory PCR reakce a může dosáhnout skutečné absolutní kvantifikace bez standardních produktů, což se stalo výzkumným a aplikačním hotspotem.

Podle různých forem reakční jednotky ji lze rozdělit do tří typů: mikrofluidní, čipové a kapkové systémy.


Čas odeslání: Červenec-08-2021