• Facebook
  • linkedin
  • Youtube

Vynikající vlastností PCR reakce je její velká amplifikační kapacita a extrémně vysoká citlivost.Abychom zlepšili výkon PCR a účinnost detekce, zavázali jsme se zlepšit kapacitu amplifikace PCR a citlivost detekce, ale bolest hlavy je v procesu experimentu.Často dochází k falešně pozitivním výsledkům a velmi malé množství křížové kontaminace vzorku nebo kontaminace PCR produktem může způsobit falešné pozitivní výsledky v experimentu.

Pět typů kontaminace PCR produktů

Existuje mnoho důvodů pro kontaminaci PCR, které lze zhruba rozdělit do následujících kategorií:

1. Křížová kontaminace mezi vzorky

1.1

Kontaminace vzorku je způsobena zejména kontaminací nádoby pro odběr vzorku nebo při umístění vzorku dochází k jeho úniku z nádoby v důsledku uvolněného těsnění nebo je vzorek přilepen na vnější stranu nádoby, což způsobuje křížovou kontaminaci;Kontaminace vede ke kontaminaci mezi vzorky;některé mikrobiální vzorky, zejména viry, se mohou šířit aerosoly nebo vytvářet aerosoly, což má za následek vzájemnou kontaminaci.

2. Kontaminace PCR reagencií

Hlavním důvodem je, že během přípravy PCR reagencií jsou vzorkovací pistole, nádoba, dvakrát destilovaná voda a další roztoky kontaminovány templátem nukleové kyseliny PCR.

1.2

3.Kontaminace klonovacím plazmidem

1.3

V laboratořích molekulární biologie a některých laboratořích, které používají klonované plazmidy jako pozitivní kontroly, je problém kontaminace klonovanými plazmidy také běžný.Vzhledem k tomu, že obsah klonovacího plazmidu v jednotkovém objemu je poměrně vysoký a v procesu čištění je zapotřebí více nástrojů a činidel, je velmi pravděpodobné, že plazmid v živých buňkách bude kontaminován v důsledku silné růstové a reprodukční schopnosti živých buněk.

4.Kontaminace amplifikovaných produktů

Kontaminace amplifikovaných produktů je nejčastějším problémem kontaminace v PCR reakcích.Protože množství kopií produktu PCR je velké (obecně 1013 kopií/ml), což je mnohem více než limit počtu kopií detekce PCR, velmi malé množství kontaminace produktu PCR může způsobit falešně pozitivní výsledky.

1.4

5.Znečištění aerosolem

1.5

Aerosolové znečištění je nejpravděpodobnější formou kontaminace produktů PCR a je také nejsnáze přehlédnutelné.Vzniká třením mezi povrchem kapaliny a vzduchem.Obecně může dojít ke kontaminaci aerosolem při otevření víka, při odsávání vzorku nebo dokonce při silném protřepávání reakční zkumavky.Aerosolová částice může podle propočtů obsahovat 48 000 kopií, takže znečištění jí způsobené je problémem, který si zaslouží zvláštní pozornost.

Zejména testovací laboratoře často používají stejný pár primerů k testování určitého genu.V průběhu času dojde v prostoru laboratoře k velkému množství kontaminace PCR produktů.Jakmile k takové kontaminaci dojde, je obtížné ji v krátké době odstranit.

U prvních tří typů znečištění můžeme použít účinné prostředky, jak se jim vyhnout, ale znečištění způsobenému produkty PCR je obtížné zabránit, zejména při výstavbě nestandardních laboratoří PCR.V procesu PCR, když špička pipety nasává a vyfukuje kapalinu a otevře se kryt zkumavky PCR, vytvoří se aerosol.Molekuly DNA nesené aerosolem (jeden aerosol může nést desítky tisíc DNA) je obtížné odstranit, protože se vznášejí ve vzduchu.Jakmile bude zavedeno další kolo experimentů PCR, nevyhnutelně dojde k falešným pozitivům.

Jak je znázorněno na obrázku níže, negativní kontrola také amplifikovala odpovídající pásmo zájmu:

1.6

Je zde uvedena první část této problematiky znečištění a prevence PCR.Příští číslo vám přinese druhý díl „Prevence kontaminace PCR produktů“, takže zůstaňte naladěni!


Čas odeslání: 25. července 2017