• Facebook
  • linkedin
  • Youtube

Přímá PCR je reakce, která přímo využívá živočišné nebo rostlinné tkáně k amplifikaci bez extrakce nukleové kyseliny.V mnoha ohledech funguje přímá PCR jako běžná PCR

Hlavním rozdílem je vlastní pufr používaný v přímé PCR, vzorek lze přímo podrobit PCR reakci bez extrakce nukleové kyseliny, ale jsou zde odpovídající požadavky na toleranci enzymů a kompatibilitu pufru zapojeného do přímé PCR reakce.

Přestože je v běžných vzorcích více či méně inhibitorů PCR, přímá PCR může stále dosáhnout spolehlivé amplifikace za působení enzymů a pufrů.Tradiční PCR reakce vyžaduje vysoce kvalitní nukleovou kyselinu jako templát, který může inhibovat hladký průběh PCR reakce, pokud templát obsahuje proteiny a jiné nečistoty.Direct PCR je v současnosti jednou z nejpopulárnějších technologií v oblasti molekulární diagnostiky.

01 Direct PCR byl původně používán pro zvířata a rostliny

Nejstarší aplikace přímé PCR je v oblasti zvířat a rostlin, jako je krev, tkáň a vlasy krys, kočky, kuřat, králíků, ovcí, skotu atd., listy a semena rostlin atd., používané ke studiu genotypizace, transgenní, plasmidové detekce, genové knockout analýzy, identifikace zdroje DNA, identifikace druhů, analýzy SNP a dalších oborů.

Tato pole mají některé společné rysy, to znamená, že obsah cílového genu je relativně vysoký a extrakce nukleových kyselin je problematická, takže přímá PCR může nejen ušetřit čas a mít malý dopad na výsledky, ale také ušetřit náklady.

Přímá PCR použitá pro detekci patogenů je záležitostí posledních let, někteří výrobci PCR reagencií v tomto směru při inovacích vyvinuli velké úsilí.Zejména v této epidemii COVID-19 se na trhu objevilo mnoho takových detekčních produktů, jako je SARS-CoV-2 Nucleic Acid Detection Kit (Multiplex PCR Fluorescent Probe Method) prozkoumaný a vyvinutý společností Foregene, který využívá technologii Real-time RT PCR (rRT-PCR) pro kvalitativní detekci vzorků SARS-CoV-2 kyselin z nosní sliznice nebo nukleárních buněk nosní sliznice.

Foregene je jednou ze společností využívajících technologii Direct PCR k detekci normálních ORF1ab, N, E avarianta linie nukleových kyselin ve vzorcích lidských nasofaryngeálních nebo orofaryngeálních výtěrů, jako je linie SARS-CoV-2 B.1.1.7 (UK), linie B.1.351 (ZA), linie B.1.617 (IND) a linie P.1 (BR).

02  Reagencie potřebné pro přímou PCR

Lyzát vzorku

Lyzát vzorku si můžete sami nakonfigurovat nebo zakoupit.Rozdíl ve složení různých značek lyzátu způsobí, že schopnost lýzy se bude lišit a doba lýzy se pak bude mírně lišit.Například pro přípravu vzorků zvířecí tkáně se obecně doporučuje 30 minutová nebo noční lýza a lyzační roztok pro viry se pohybuje v rozmezí 3-10 minut.

PCR master mix

Ke zvýšení specifické amplifikace a zvýšení schopnosti amplifikace se doporučuje použít hot-start DNA polymerázu.Jádrem přímé PCR je vysoce tolerantní polymeráza.

Odstraňte nebo inhibujte složky ve vzorku, které ovlivňují amplifikaci DNA

Po zpracování vzorku s lyzátem se uvolní proteiny, lipidy a další buněčné zbytky, které budou inhibovat PCR reakci.Proto přímá PCR vyžaduje přidání odpovídajícího odstranění nebo inhibitorů, aby se snížil vliv těchto faktorů.

03  Sbírka pěti znalostních bodů přímé PCR

Za prvé, technologie Direct PCR je přímá technologie PCR pro různé biologické vzorky.Za těchto technických podmínek není potřeba oddělovat a extrahovat nukleovou kyselinu, přímo použít vzorek tkáně jako objekt a přidat primery cílového genu pro provedení PCR reakce.

Za druhé, technologie Direct PCR není pouze tradiční technologií amplifikace templátu DNA, ale zahrnuje také reverzní transkripční PCR templátu RNA.

Za třetí, technologie Direct PCR nejen přímo provádí rutinní kvalitativní PCR reakce na tkáňových vzorcích, ale zahrnuje také reakce qPCR v reálném čase, které vyžadují, aby reakční systém měl silnou schopnost interferovat s fluorescencí na pozadí a endogenní fluorescence zhášela antagonistickou schopnost.

Za čtvrté, vzorky cílené technologií Direct PCR potřebují pouze uvolnění templátů nukleové kyseliny a neodstraňují proteiny, polysacharidy, ionty solí atd., které interferují s reakcí PCR.Což vyžaduje, aby polymeráza nukleové kyseliny a PCR Mix v reakčním systému měly vynikající odolnost a adaptabilitu pro zajištění enzymové aktivity a přesnosti replikace za složitých podmínek.

Za páté, tkáňový vzorek cílený technologií Direct PCR bez jakéhokoli ošetření obohacením nukleové kyseliny a množství templátu je velmi malé, což vyžaduje, aby reakční systém měl extrémně vysokou citlivost a účinnost amplifikace.


Čas odeslání: 28. června 2021